Construction and expression of recombinant plasmid pEGFP-mDlx5 in neural stem cells derived from anterior subventricular zone of neonatal rats

目的 构建真核表达重组质粒pEGFP-mD1x5,并了解它在室管膜前下区(SVZa)神经干细胞(NSCs)中的mRNA及融合蛋白表达情况.方法运用DNA重组技术自原核表达载体上将小鼠来源的mD1x5基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)载体上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用电穿孔的方法转染SVZaNSCs,荧光显微镜下动态观察荧光变化情况;培养24h后提取转染细胞的总RNA及总蛋白,通过逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)了解其mRNA表达情况,用Western blot检测其蛋白表达情况.结果重组质粒通过双酶切产生了0.78kb目的插入片段及4.68kb载体片段;测序后证实0.78kb片段碱基序列与mDlx5基因完全同源;重组质粒转染SVZaNSCs 8 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,12 h后逐渐增多,24～48 h达高峰,且稳定表达较长时间;24 h后通过RT-PCR检测到mRNA表达,Westernblot检测到58 kD目的蛋白表达.结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-mDlx5通过鉴定,结构正确;转染到SVZaNSCs后能在其中表达、发挥功能,为后续研究奠定了基础。