Estudo do papel da IL-10 endógena e da expressão de pequenos RNAs na modulação da resposta imune durante a infecção pela bactéria intracelular Brucella abortus

Brucella abortus e uma bacteria Gram-negativa, que causa uma doenca cronica em bovinos, humanos e outras especies denominada brucelose. IFN-γ e crucial para o controle da B. abortus enquanto a IL-10 e conhecida por diminuir a producao desta citocina in vitro interferindo diretamente no processo da eliminacao do patogeno. Associado ao papel da IL- 10, estudos recentes tem demonstrado que os miRNAs atuam na regulacao postranscricional da expressao das citocinas pro-inflamatorias. Estimulados pelo interesse em analisar o papel do controle da resposta imune inflamatoria, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel da IL-10 endogena e dos miRNAs durante a infeccao pela B. abortus. No estudo do papel da IL-10, camundongos IL-10 KO ou 129 Sv/Ev foram infectados com a cepa S2308 de B. abortus e em todas as semanas analisadas, camundongos IL-10 KO apresentaram menor numero de bacterias recuperadas no baco, em relacao ao grupo controle, evidenciando-se a completa eliminacao da bacteria com 14 semanas apos a infeccao. Ademais, foi observado um aumento da producao de IFN-γ, TNF-α e IL-17 em soro e em cultura dos esplenocitos, e levados niveis de IL-12 e TNF-α em BMDCs dos animais IL-10 KO quando infectados pela B. abortus. Granulomas multifocais e necrose do tecido hepatico dos animais infectados foram observados em analises histopatologicas, contudo, houve uma grande reducao no numero de granulomas nos animais IL-10 KO. Esta reducao na patologia hepatica foi acompanhada do aumento no numero de celulas Tregs e do aumento da expressao de TGF-β em cultura de esplenocitos dos animais IL-10 KO. Juntamente, os resultados demonstraram que a IL-10 modula a resposta imune proinflamatoria contra B. abortus e a ausencia desta citocina aumenta a resistencia a infeccao por esta bacteria. A fim de estudar o papel dos miRNAs nesta infeccao, amostras de RNA total de BMDMs nao infectados ou infectados foram sequenciados restringindo-se a analise de pequenos RNAs. Os resultados do RNAseq demonstraram que 81% das reads foram mapeadas em genes codificadores de miRNAs. Setecentos e quarenta e cinco miRNAs foram identificados em ambas bibliotecas, onde 18 miRNAs apresentaram-se diferencialmente expressos. Destes, 7 miRNAs foram validados com aumento de expressao e 5 miRNAs com diminuicao de expressao. Dos miRNAs validados, foi observada a dependencia da molecula MyD88 para o aumento da expressao do mmu-miR-181a-5p e do mmu-miR-99a-5p. O mmu-miR-328-3p apresentou diferencas na expressao quando comparados ao animal C57BL/6 na ausencia de STING, mas nao em celulas de MyD88 KO. Os mmu-miR-21a-5p, mmu-miR-98-5p e mmu-miR-146b-5p demostraram que a molecula MyD88 tem um importante papel na manutencao da diminuicao da expressao destes miRNAs. Para a molecula STING o mmu-miR-146b-5p apresentou uma diminuicao de expressao ainda maior quando comparada ao animal selvagem. Dentre os miRNAs diferencialmente expressos os mmu-miR-181a-5p e mmu-miR-21a-5p foram selecionados para as analises seguintes. Analises in silico identificaram 730 putativos alvos para mmumiR- 181a-5p e 328 alvos para mmu-miR-21a-5p. Analises de enriquecimento das vias biologicas destes putativos alvos, indicaram 19 e 13 vias biologicas para os mmu-miR-181a- 5p e mmu-miR-21a-5p, respectivamente. Para as analises biologicas destes miRNAs BMDMs foram transfectados com mimic ou inhibitors especificos resultando no aumento ou na diminuicao da quantidade dos miRNAs nas celulas. A expressao dos genes codificadores de TNF-α ou IL-10 foram analisados em celulas transfectadas e infectadas pela B. abortus demonstrando o efeito dos mmu-miR-181a-5p e mmu-miR-21a-5p, respectivamente, no controle da expressao destas importantes citocinas. Ate o presente momento, os resultados indicam um perfil de miRNAs diferencialmente expressos durante a infeccao pela B. abortus e estudos futuros irao esclarecer o papel destes miRNAs na regulacao da resposta imune durante a infeccao pela B. abortus.