靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒的构建

目的：构建靶向PD-L1基因的CRISPR/Cas9基因敲除质粒。方法：根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并合成靶向PD-L1基因的5对sgRNA序列。为了进一步降低克隆背景和提高构建阳性率,在受体载体中引入毒性蛋白系统（Ccd）。构建p X459-Ccd B重组载体,将p X459-Ccd B载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到p X459-Ccd B骨架载体中,转化到不含Ccd A基因的宿主菌Stbl3中。酶切不完全引起的背景载体将因毒性蛋白的作用杀死宿主菌。转化后挑取阳性克隆,进行PCR和测序验证。结果与结论：经PCR和测序验证,重组质粒p X459-PD-L1-sgRNA构建成功,为下一步体内外敲除PD-L1基因和深入研究其在肿瘤免疫逃逸中的功能奠定了基础。