Eine Plasmaextraktion durch Free-Flow-Elektrophorese ermöglicht die selektive Bestimmung von Insulinanaloga in Gegenwart von endogenem Normalinsulin

Fragestellung: Die spezifische Bestimmung der Insulinanaloga Glargine, Detemir, Aspart, Lispro und Glulisine ist eine schwierige analytische Fragestellung, insbesondere, wenn im Plasma der Patienten auch noch endogenes Insulin vorhanden ist. Wahrend fur diese Analoga in vielen Fallen Kreuzreaktivitaten mit anderen Tests fur Normalinsulin beobachtet wurden, ist lediglich fur Insulin lispro aktuell ein spezifischer Radioimmunoassay verfugbar. Methodik: Wir untersuchten in dieser Pilotstudie die Moglichkeit, dieses Trennproblem durch quantitative pra-analytische Serumseparation mithilfe der Free-Flow-Elektrophorese zu losen. Hierfur wurde Plasma von gesunden freiwilligen Personen gewonnen und mit allen verschiedenen Insulinanaloga versetzt, so dass diese jeweils in therapeutisch relevanten Konzentrationen (20–100µl) vorlagen. Anschliesend wurden die Proben verdunnt und Aliquote direkt einer Plasmaseparation durch Free-Flow-Elektrophorese (FFE) unterzogen. Bei dieser Methode werden die Plasmaproteine entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt in einem laminaren Flussigkeitsfilm elektrophoretisch aufgetrennt. Da keine Trennmatix vergleichbar der Chromatographie oder Geleelektrophorese vorhanden ist, konnen die Proteine unter nativen Bedingungen in kurzer Zeit mit hoher Reproduzierbarkeit getrennt werden. Nach Optimierung der Methode fur die Trennung der verschiedenen Analoginsuline wurden diese quantitativ gesammelt und mittels eines bekanntermasen mit allen Analoga kreuzreaktiven Chemilumineszenztests fur Normalinsulin gemessen (Invitron, Cardiff, UK). Der Nachweis der Identitat der Analoginsuline in ihren jeweiligen Fraktionen erfolgte vorher durch Gelelektrophorese und mittels Massenspektroskopie. Ergebnisse: Bei diesen Pilotexperimenten zeigte lediglich Lispro eine vergleichbare Trenncharakteristik wie Normalinsulin (identische isoelektrische Punkte) und musste mit dem spezifischen Immunoassay (Millipore, St. Charles, MO) bestimmt werden. Alle anderen Insulinanaloga konnten aus der artifiziell kombinierten Plasmaprobe quantitativ abgetrennt und mit hoher Wiederfindungsrate bestimmt werden. Schlussfolgerungen: Nach diesen erfolgreichen Versuchen, wird die Methode nun im nachsten Schritt standardisiert und validiert, damit die notwendige Qualitat, Prazision und Genauigkeit fur den Einsatz der FFE-Technologie auch im Rahmen klinischer Studien erreicht wird.