Promotor-gestützte in vivo-Markierung stabil transfizierter embryonaler Stammzellen zur Aufreinigung kardial differenzierter Subpopulationen: Ansatz zur Zelltherapie ischämischer Herzerkrankungen

Embryonale Stammzellen stellen aufgrund ihrer Fahigkeit, in vitro in verschiedene Subtypen von Kardiomyozyten zu differenzieren, eine vielversprechende Quelle fur eine spezifische Zellersatztherapie ischamischer Herzerkrankungen dar. Ein wesentliches Hindernis, das grose therapeutische Potenzial embryonaler Stammzellen fur klinische Zelltransplantationen zu nutzen, besteht darin, dass es bisher kein geeignetes Verfahren gibt, den gewunschten Zelltyp zu isolieren. Die Applikation hochaufgereinigter definierter Subpopulationen ist jedoch Voraussetzung, um optimale funktionelle Effekte zu erzielen und andererseits eine potenzielle intramyokardiale Teratomformation aus mittransplantierten undifferenzierten ES-Zellen zu vermeiden. Die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren zur Expression eines transgenen Oberflachenmarkers konnte die zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung eines gewunschten aus ES-Zellen gewonnenen Zelltyps mit hoher Ausbeute ermoglichen und damit eine wichtige Basis fur kunftige Zelltransplantationen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Protokoll etabliert, um mittels der magnetischen Zellsortierung (MACS), dem gegenwartigen Goldstandard einer zellschonenden und effizienten Zellseparation, stabil transfizierte murine embryonale Stammzellen aufzureinigen. Fur MACS wurden ES-Zellen markiert, die ein intrazellular trunkiertes CD4-Oberflachenprotein (∆CD4) unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven PGK-Promotors stabil exprimierten. Um die markierten Zellen in vivo fluoreszenzmikroskopisch detektieren zu konnen, erfolgte in einem Parallelansatz eine Fusion des ∆CD4 mit einem intrazellularen EGFP-Teil (∆CD4EGFP). Die Funktionalitat dieses Fusionsproteins wurde ebenso gezeigt wie dessen Eignung fur die MACS-Aufreinigung, mit welcher Reinheiten von uber 97% erzielt wurden. Die Expression des ∆CD4-Molekuls ohne EGFP-Anteil fuhrte nach MACS zu uber 98% positiven vitalen Zellen. Dabei waren die jeweils erzielten Reinheiten unabhangig von dem Differenzierungszustand der Zellen und der initialen Frequenz positiver Zellen (0,6% bis 16%). Die Vitalitat der aufgereinigten Zellen nach dem MACS-Prozess wurde dadurch belegt, dass diese in der Lage waren, zu reaggregieren und normale „Embryoid Bodies“ auszubilden, die Marker aller drei embryonaler Keimblatter exprimierten. Parallel zur Etablierung der MACS-Methode wurde der kardial spezifische humane 2,75kb Nkx2.5-Promotor uber die Expression des in vivo-Markers EGFP in murinen embryonalen Stammzellen untersucht. Die fluoreszenzmikroskopischen und durchflusszytometrischen Ergebnisse korrelierten mit dem erwarteten embryonalen Aktivitatsprofil des Nkx2.5-Promotors. RT-PCR-Analysen fruher kardialer Marker zeigten, dass der hNkx2.5-Promotor Zellen markiert, deren Expressionsmuster dem fruher kardial determinierter Zellen entspricht. Der 2,75 kb lange hNkx2.5-Promotor bietet damit einen vielversprechenden Ansatz, kardiale Vorlauferzellen innerhalb des heterogenen Zellspektrums sich differenzierender ES-Zellen zu identifizieren. Ein Transfer auf das in dieser Arbeit etablierte MACS-System konnte die effiziente, zellschonende und nicht immunogene Aufreinigung kardialer Vorlauferzellen aus humanen ES-Zellen ermoglichen. Dieser Ansatz konnte die Therapie ischamischer Herzmuskelerkrankungen mit embryonalen Stammzellen der klinischen Anwendung einen entscheidenden Schritt naher bringen.