Establishment of defined culture conditions for the differentiation, long-term maintenance and co-culture of adipose-derived stem cells for the setup of human vascularized adipose tissue

Most current attempts in engineering adipose tissue are based on the supplementation with human or animal-derived sera. However, especially the use of animal-derived serum is linked to many disadvantages, like potential contaminations, ethical issues and in general the missing identification of many ingredients. Therefore, serum supplementation impedes the actual application of engineered adipose tissue constructs as implants, to substitute lost tissue after tumor resection, severe burnings or trauma. Equally, due to a potential cover up of the cellular response by unidentified components, it impairs the in vitro use of such models as test systems to elucidate mechanisms of disease development, screen for new drugs or generally assess pharmaceutical safety levels. To be capable for functional anastomosis with the host tissue after implantation and for the use in time- and maturation-dependent in vitro purposes, engineered constructs have to exhibit a minimum sustainability. So far, only few authors addressed the serum-free, defined differentiation of adipocytes. And there are hardly any trials available on the defined maintenance of adipocytes. In this study, the development of a defined culture medium for the adipogenic differentiation of primary human adipose-derived stem cells (ASCs) was aimed. Based on the addition of specific factors for the replacement of serum, ASCs were differentiated to viable and characteristic adipocytes for 14 days, which was proven through the accumulation of lipids, the expression of perilipin A and by the release of leptin and glycerol. Furthermore, a defined maintenance medium was developed, which supported the maturation and stability of cells for a long-term period of additional 42 days until day 56. In order to pursue the goal of a physiological tissue substitute of relevant size, the integration of a vascular component is of fundamental importance to allow sufficient nutrient supply of all peripheral tissue areas. For this purpose, a natural vascular system based on a cellular component would be ideal. Due to the lack of an adequate co-culture medium, a major challenge in adipose tissue vascularization is represented by the setup of an adipocyte/endothelial cell (EC) co-culture. In this study, the development of a tissue-tailored co-culture medium based on adipocyte- and EC-factors was developed. Thereby the critical role of epidermal growth factor (EGF) and hydrocortisone (HC) in adipocyte/microvascular (mv)EC co-culture was determined. Through the adjustment of their supplementation, a functional co-culture of adipocytes and mvECs was achieved. In there, mvECs maintained the cell-specific expression of von Willebrand factor (vWF) and cluster of differentiation 31 (CD31). Additionally, cells kept their ability to incorporate acetylated low density lipoprotein (acLDL). By combining the experiences from both mentioned attempts, a defined adipocyte/EC co-culture medium was developed. Next to the maintenance of functional and characteristic adipocytes, the medium facilitated the formation of vascular-like structures in the direct co-culture. To be able to establish tissue constructs of relevant size, current in vitro attempts have to be transferred to a three-dimensional (3D) environment. In this trial, a 3D adipose tissue model was set up based on the differentiation of ASCs in a collagen type I hydrogel in co-culture with mvECs for 21 days in total. The comparison of these models with native adipose tissue demonstrated high accordance in the gene expression levels related to differentiation and fatty acid metabolism. Some deviations were found mostly in maturation-dependent genes linked to tissue functionality and angiogenic mediation. Differentiation and the maintenance of a homeostatic tissue state highly rely on the physical and chemical characteristics of the applied scaffold. As another part, the influence of a novel cellulose-based material (CBM) on defined adipogenic differentiation of ASCs and the defined maintenance of mvECs was investigated in this thesis. An accelerating effect of CBM on the defined differentiation of ASCs was proven by enhanced release of leptin and the increased expression of perilipin A. CBM was further shown to facilitate the formation of vascular-like structures by mvECs under defined conditions in the absence of another supporting cell type. Additionally, the successful co-culture of adipocytes and mvECs was demonstrated on CBM under defined conditions. Summarized, defined culture media for the differentiation, maintenance and co-culture of primary ASC and mvECs were developed. The supporting effect of CBM on the defined establishment of cultures was proven. Further the successful setup of a 3D adipocyte/mvEC co-culture model with a high predictive power was shown. Combined these achievements can be used for the in vitro setup of a 3D vascularized adipose tissue under defined conditions. Die meisten aktuellen Ansatze zum Aufbau eines kunstlichen Fettgewebekonstruktes basieren auf dem Einsatz von Blutseren. Speziell die Verwendung von tierischem Serum ist jedoch mit vielen Nachteilen verbunden. Dazu zahlen potentielle Kontaminationen, grose Variationen zwischen den Chargen und die vielen, nicht identifizierten Komponenten. Die Supplementierung mit Serum behindert so den Einsatz von kunstlichen Fettgewebekonstrukten als Implantat zum Ersatz von Gewebe nach einer Tumorentfernung, schweren Verbrennungen oder Traumata. In vitro Ansatze z.B. zur Aufklarung von Krankheitsentstehungen, der Entwicklung oder Sicherheitseinstufung von Medikamenten, basieren auf der zellularen Antwort, welche ebenfalls durch Serum-Komponenten verschleiert werden kann. Zudem sollten Fettgewebekonstrukte eine grundsatzliche Stabilitat aufweisen um nach der Implantation eine ausreichende Anastomose mit dem Empfangergewebe und die Nutzung fur zeit- und reifeabhangige in vitro Fragestellungen zu ermoglichen. Die definierte serumfreie Differenzierung von Adipozyten wurde bisher nur von wenigen Autoren adressiert. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung definierter Kulturmedien fur die adipogene Differenzierung humaner primarer Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells, ASCs) angestrebt. Durch die Zugabe von spezifischen Faktoren als Alternative zu Serum, erfolgte eine 14-tagige Differenzierung zu viablen und charakteristischen Adipozyten, was sich durch die Einlagerung von Lipiden, der Expression von Perilipin A und der Freisetzung von Leptin und Glycerol bestatigen lies. Weiterhin wurde ein definiertes Erhaltungsmedium entwickelt, welches die Reifung der Adipozyten uber einen Kulturzeitraum von 42 Tagen bis zu Tag 56 unterstutzte. Zur ausreichenden Versorgung, auch peripher gelegener Geweberegionen, ist die Integration einer vaskularen Komponente beim Aufbau eines physiologischen Gewebeersatzes in relevanter Grose fundamental. Idealerweise sollte das vaskulare System aus einer naturlichen, zellularen Komponente bestehen. Durch den Mangel eines adaquaten Co-Kulturmediums, stellt der Aufbau einer Adipozyten/Endothelzell (endothelial cell, EC) Co-Kultur bei der Vaskularisierung von Fettgewebe eine zentrale Herausforderung dar. In dieser Arbeit wurde ein gewebespezifisches Co-Kulturmedium mit Adipozyten- und EC-Faktoren entwickelt. Hierbei zeigte sich die kritische Rolle vom epidermalen Wachstumsfaktor (epidermal growth factor, EGF) und Hydrocortison (HC) in der Co-Kultur von Adipozyten und mikrovaskularen (mv)EC. Durch die Supplementanpassung lies sich eine funktionelle Adipozyten/mvEC Co-Kultur aufbauen. Darin erhielten die mvECs die zellspezifische Expression des von Willebrand Faktors (vWF) und des Oberflachenmarkers 31 (Cluster of differentiation, CD31). Auserdem behielten sie die Fahigkeit zur Aufnahme von acetyliertem Lipoprotein niedriger Dichte (acetylated low density liporotein, acLDL). Durch die Erkenntnisse aus beiden Ansatzen lies sich ein definiertes Adipozyten/EC Co-Kultur-medium entwickeln. Neben dem Erhalt funktioneller und charakteristischer Adipozyten, unterstutze das Medium in direkter Co-Kultur die Ausbildung vaskularer Strukturen. Zum Aufbau von Gewebekonstrukten relevanter Grose ist die Uberfuhrung der aktuellen Ansatze in eine dreidimensionale (3D) Umgebung notwendig. In dieser Thesis wurde ein 3D Fettgewebekonstrukt mit differenzierten ASCs in einem Kollagen Typ I Hydrogel in Co-Kultur mit mvECs uber 21 Tage aufgebaut. Im Vergleich der Modelle mit nativem Gewebe zeigte sich eine grostenteils ubereinstimmende Expression von Genen, die mit der Differenzierung und dem Fettstoffwechsel verbunden sind. Abweichungen wurden hingegen bei zumeist reifeabhangigen Genen, die im Zusammenhang mit der Gewebefunktionalitat und angiogenen Prozessen stehen, festgestellt. Die Differenzierung und eine homeostatische Gewebeerhaltung hangen masgeblich von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des eingesetzten Biomaterials ab. In einem weiteren Teil dieser Thesis wurde der Einfluss eines neuartigen Cellulose-basierten Materials (CBM) auf die definierte adipogene Differenzierung und die definierte mvEC Erhaltung untersucht. Die erhohte Ausschuttung von Leptin und die Expression von Perilipin A zeigte einen beschleunigenden Effekt von CBM auf die Differenzierung von ASCs. Weiterhin ermoglichte CBM die Ausbildung vaskularer Strukturen in der definierten Kultur ohne die Unterstutzung weiterer Zelltypen. Schlieslich gelang die definierte Co-Kultur von Adipozyten und mvECs auf CBM. Zusammengefasst wurden in dieser Arbeit definierte Medien zur Differenzierung, Erhaltung und Co-Kultur von primaren ASCs mit mvECs entwickelt. CBM zeigte einen unterstutzenden Effekt im definierten Ansatz dieser Kulturen. Auserdem gelang der Aufbau einer 3D Adipozyten/mvEC Co-Kultur. In Kombination konnen diese Ergebnisse zum Aufbau eines vaskularisierten 3D Fettgewebekonstruktes unter definierten Bedingungen genutzt werden.