利用荧光共振能量转移技术研究TGF-β/Smad3信号转导通路

转移生长因子-β1（TGF-β1）/Smad3信号转导通路与人类的多种生理病理发生机制相关,但是该信号通路中Smad3被磷酸化的时空信息仍然不完全清楚。为了动态观察活细胞生理状态下Smad3被磷酸化的过程,首先进行ECFP-Smad3-Citrine（Smad3biosensor）融合蛋白表达载体的构建及鉴定;然后转染293T细胞并观察转染效率和融合蛋白表达情况。在荧光显微镜下,应用MetaFlour FRET 4.6软件测量TGF-β1刺激293T细胞前后Smad3biosensor的荧光能量共振转移（FRET）的变化情况。结果显示,Smad3biosensor转染效率达40%,融合蛋白表达成功。TGF-β1刺激293T细胞10min后,监测到胞质内FRET值逐渐减小,青色荧光蛋白（CFP）减弱,黄色荧光蛋白变体（Citrine）增强,历时约300s后逐渐恢复。应用FRET技术能使我们在活细胞生理状态下,实时动态监测TGF-β1/Smad3信号转导通路的过程。