miR-124靶向抑制NFATc1调控小鼠C3H10T1 /2细胞软骨分化的研究

目的研究miR-124是否通过调控预测的靶基因活化T细胞核因子c1 (NFATc1)表达调节小鼠C3H10T1/2细胞的软骨分化。 方法培养C3H10T1/2细胞，行软骨诱导分化，采用实时定量PCR和蛋白免疫印迹法检测NFATc1和软骨标记基因Aggrecan、CollagenⅡ、Collagen X mRNA及蛋白的表达水平。使用在线靶基因预测软件预测NFATc1 mRNA的3'端非翻译区(3’UTR)结合位点，构建NFATc1 3'UTR野生型及突变型的荧光素酶报告载体，检测双荧光素酶报告基因，观察miR-124对NFATc1 3'UTR荧光素酶活性的影响。转染miR-124模拟物或抑制物并进行软骨诱导，观察miR-124对NFATc1的调控作用。 结果与诱导前比较，成软骨诱导组软骨分化相关基因Aggrecan、Col2a1和Col10a1 mRNA表达水平升高( P 均＜0.01)；Sox 9和NFATc1 mRNA表达水平随着软骨分化进展而增加( P 均＜0.001)；Col2a1、Sox 9和NFATc1蛋白呈逐渐增强表达，而肥厚性标记Col10a1蛋白显示较稳定表达。NFATc1 mRNA的3'UTR与miR-124的种子区存在理论上的互补碱基配对序列。转染NFATc1野生型质粒的C3H10T1/2细胞中，加入miR-124模拟物者的荧光素酶活性低于加入miR-124抑制物者，加入miR-124抑制物者的蛋白表达强于加入miR-124模拟物者( P 均＜0.05)；转染NFATc1突变型质粒的C3H10T1/2细胞中，加入miR-124模拟物与加入miR-124抑制物的荧光素酶活性无变化( P ＞0.05)。蛋白免疫印迹法与实时定量PCR结果均显示，转染miR-124组与si-NFATc1组的NFATc1表达水平低于Control组( P 均＜0.01)，miR-124组与si-NFATc1组的NFATc1表达水平相近( P >0.05)。过表达miR-124后，NFATc1大约降低了60%，而这种降低可被miR-124抑制物逆转。转染NFATc1野生型质粒的miR-124模拟物组的NFATc1荧光素酶活性减低( P 均＜0.05)，转染NFATc1突变型质粒的miR-124模拟物组NFATc1荧光素酶活性无变化( P 均>0.05)。 结论miR-124通过抑制靶基因NFATc1的表达调控C3H10T1/2细胞软骨分化。