Molecular mechanism regulating post-translational control ofPED/PEA-15 expression

PED/PEA-15 (Phosphoprotein Enriched in Diabetes/Phosphoprotein Enriched in Astrocytes-15) e una proteina di 15 kDa sovraespressa in pazienti con diabete mellito di tipo 2. La sovraespessione di PED/PEA-15 in cellule in coltura e in topi transgenici altera l’azione dell’insulina. Inoltre, i topi transgenici sovraesprimenti PED/PEA-15 mostrano una maggiore suscettibilita alla formazione di tumori della pelle indotti chimicamente. Numerose evidenze indicano che l’espressione della proteina PED/PEA-15 e finemente regolata dal suo stato di fosforilazione, in particolare, la proteina PED/PEA-15 e fosforilata sulla serina 116 da CaMKII e da Akt/PKB e tale fosforilazione regola la sua emivita. In questo lavoro ho studiato la capacita della proteina chinasi C (PKC) di regolare i livelli di espressione della proteina PED/PEA-15. In cellule 293, sovraesprimenti stabilmente PED/PEA-15, la stimolazione con TPA, un potente attivatore di PKC, induce un significativo aumento dei livelli di espressione di PED/PEA-15. Il medesimo effetto del TPA e stato osservato anche in cellule HeLa e in cheratinociti che esprimono livelli endogeni di PED/PEA-15. In seguito ho usato oligonucleotidi antisenso fosforotioati per inibire le singole isoforme di PKC. Il trattamento di cellule 293PED con l’antisenso di PKCζ ha ridotto l’espressione di PED/PEA-15 suggerendo che PKCζ endogeno selettivamente regola i livelli di PED/PEA-15. Inoltre, l’inibizione di PKCζ previene l’aumento dell’espressione di PED/PEA-15 indotto dal TPA. Indi ho studiato la regolazione dell’espressione di PED/PEA-15 da parte del TPA in cellule 293 stabilmente trasfettate con PEDwt e con i mutanti PEDS104G o PEDS116G. La stimolazione con TPA ha incrementato di 4 volte i livelli di PEDwt e PEDS104G ma non e stata in grado di indurre un aumento dei livelli di PEDS116G. Anche la sovraespressione del cDNA di PKCζ in cellule 293 esprimenti PEDwt o PEDS104G ha indotto un incremento significativo dell’espressione di PED/PEA-15 mentre non ha avuto alcuno effetto sull’espressione di PEDS116G. Inoltre ho anche dimostrato che PED/PEA-15 e ubiquitinata e che tale ubiquitinazione e regolata dal TPA. Infine, la lactacistina, un inibitore del proteosoma, ha revertito l’effetto del blocco dell’antisenso di PKCζ sull’espressione di PED/PEA-15. Quindi in questo lavoro di tesi ho mostrato che PKCζ regola l’espressione di PED/PEA-15 inibendo la sua degradazione nel compartimento proteosomale. Cio potrebbe essere parte di un meccanismo attraverso il quale l’iperattivazione di PKC altera l’azione dell’insulina negli stati di insulino-resistenza e/o promuove la formazione di tumori.