Multifuncionalización de nanopartículas magnéticas por reconocimiento molecular de ácidos nucleicos y péptidonucleicos para la liberación controlada mediante hipertermia

Desde la decada de los 50, debido a sus interesantes propiedades, se estan desarrollando estrategias en el diseno de nanoparticulas como sistemas portadores de farmacos para aplicaciones terapeuticas. En la actualidad siguen existiendo retos importantes en esta area, como puede ser la capacidad para guiar dichos sistemas in vivo de una manera controlada y obtener efectos terapeuticos precisos. En esta tesis doctoral, el objetivo principal fue el desarrollo de una metodologia de liberacion controlada de farmacos basada en el uso de nanoparticulas magneticas como sistemas portadores para la liberacion controlada de farmacos, ya que estas nanoparticulas poseen la propiedad de generar calor bajo la aplicacion de un campo magnetico alterno mediante la tecnica de hipertermia magnetica. Dicho trabajo engloba diferentes areas de investigacion como la quimica, farmacia, ciencia de materiales y estudios celulares in vitro e in vivo. Basandonos en el objetivo principal, cabe destacar el procedimiento de diseno de la plataforma funcional de nanoparticulas magneticas funcionalizadas con hebras de acidos nucleicos (ADN’) y peptidonucleicos (APN’) que posteriormente son conjugadas mediante puentes de hidrogeno con su hebra complementaria (ADN’’). La formacion de estos puentes de hidrogeno favorece la intercalacion del farmaco (Dox) minimizando la toxicidad de este, y mediante la aplicacion de hipertermia magnetica a la plataforma funcional formada, se liberara de forma contralada la Doxorrubicina (Dox). Las nanoparticulas magneticas (MNPs) de 12 nm con morfologia esferica en medio organico fueron sintetizadas por el metodo de descomposicion termica de un precursor organometalico (Fe(acac)3), y su estabilizacion en medio acuoso se llevo a cabo empleando un polimero anfifilico [poli (anhidrido maleico-alt-1-octadeceno) –PMAO]. La hidrolisis de las unidades de anhidrido genero grupos carboxilos orientados hacia el exterior de la capa que recubre la nanoparticula, estabilizandola asi en medio acuoso y proporcionando grupos funcionales para posteriores funcionalizaciones. Posteriormente, la funcionalizacion de las nanoparticulas se ha llevado a cabo con un derivado de glucosa (4-aminofenil β-D-glucopiranosido) proporcionando estabilidad coloidal a la plataforma funcional, y con hebras de ADN’/APN’, modificando los porcentajes de estas hebras y las condiciones de reaccion. Los resultados demostraron que la proporcion optima de la funcionalizacion con ADN’ y APN’ era (50/50). Su posterior conjugacion con su hebra complementaria (ADN’’) marcada con un fluoroforo permitio estimar la cantidad de ADN’/APN’ unida covalentemente a las nanoparticulas, ademas de formar conjugados capaces de albergas el farmaco a transportar. Una vez formada la plataforma funcional, se desarrollaron estudios de la temperatura de desnaturalizacion de las hebras conjugadas APN’-ADN’’ y ADN’-ADN’’ en disolucion, asi como las hebras conjugadas APN’-ADN’’ y ADN’-ADN’’ unidas a las MNPs. Los resultados obtenidos nos han permitido evaluar la influencia del tampon (PBS o HEPES 10 mM) utilizado, su concentracion, asi como de las diferentes longitudes de las cadenas de ADN’’ marcadas con fluoroforo, ademas de si se encuentran en disolucion o unidas a las MNPs. Por lo tanto, el tampon HEPES muestra una mayor liberacion de las hebras de ADN’’ complementario, debido a la debil fuerza ionica del tampon, a diferencia del procedimiento de hibridacion el cual es mucho mas eficaz utilizando PBS. Los posteriores ensayos de liberacion mediante calentamiento global (a 37, 50 y 90°C) e hipertermia magnetica de la plataforma funcionalizada/hibridada con sus hebras complementarias de ADN’’ demostraron mayores grados de liberacion de hebras de ADN’’ complementario al aplicar hipertermia magnetica. Los ensayos de liberacion mediante hipertermia magnetica de la plataforma funcional disenada se han llevado a cabo manteniendo la temperatura constante en el medio o no y en presencia y ausencia de una hebra de ADN’ de captura de las hebras de ADN’’ complementario liberadas. Los resultados demostraron una mayor liberacion de ADN’’ complementario manteniendo la temperatura constante en el medio (37°C) y con la presencia de hebras de ADN’ de captura, siendo dos veces superior si se comparaba con los resultados obtenidos en ausencia de control de temperatura y de hebra de captura de ADN’’. Por ultimo, se estudio el procedimiento de intercalacion de doxorrubicina (Dox) en condiciones optimas de funcionalizacion ADN’/APN’ (50/50) y su posterior liberacion de la plataforma funcional mediante calentamiento global e hipertermia magnetica, demostrando una mayor liberacion en el segundo caso. Los estudios de liberacion de la doxorrubicina calentando a la temperatura de desnaturalizacion de los conjugados ADN’/ADN’’ y APN’/ADN’’ han demostrado que, a temperatura fisiologica, la liberacion del farmaco es minima. Sin embargo, al aumentar la temperatura se ha observado un incremento de la cantidad de doxorrubicina liberada. Para los ensayos llevados a cabo con hipertermia magnetica, se ha observado una mayor liberacion del farmaco (Dox) con respecto a la llevada a cabo mediante calentamiento global sin aumentar en exceso la temperatura del medio. La liberacion mediante hipertermia magnetica, manteniendo o no la temperatura constante del medio, ha puesto de manifiesto el elevado aporte de las propiedades de las MNPs para aumentar la temperatura en la superficie de estas y por tanto obtener mejores resultados. Se ha observado una influencia en la plataforma funcional de la presencia del APN’ en la plataforma, aumentando la inestabilidad de la doxorrubicina en la doble hebra conjugada.