Regulable production of mature insulin gene in rat hepatoma cells

目的 利用基因工程的方法,建立受胰岛素负调控、地塞米松正调控的人工β细胞株.方法将已经突变的含有蛋白酶furin酶切位点的胰岛素原cDNA置于PEPCK启动子控制之下,构建表达胰岛素的逆转录病毒载体pN-PEPCK-mINS.通过脂质体法用该表达载体转染体外培养的大鼠Hepa1-6细胞,经G418(800mg/L)筛选两月后,得到表达胰岛素的细胞株.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和放射免疫分析法,从mRNA和蛋白水平观察细胞培养基中胰岛素和地塞米松浓度的变化对胰岛素基因表达的影响.结果经转染和筛选后,在获得的32个表达不同水平胰岛素(0～10.79μIU/106cells/d-1)的细胞株中挑选一株细胞Hepa1-6/INS21,其胰岛素的表达量最高,为10.79μIU/106cells/d-1.不同浓度的呋塞米和胰岛素培养Hepa1-6/INS21细胞24 h后,收集细胞培养液和细胞总RNA.检测胰岛素的结果发现10-7mol/L的地塞米松显著促进胰岛素的分泌,此时的表达量为基础水平的3.6倍;RT-PCR也证实在转录水平上外源性胰岛素明显抑制胰岛素基因的表达,而地塞米松上调其表达.结论基因工程改造肝细胞系能获得生理模式分泌胰岛素的细胞株,利用微囊包裹技术移植这类细胞可望为Ⅰ型糖尿病患者提供一种安全可行的治疗手段。