Standarization of a SYBR Green-I based real-time RT-PCR assay for detection of bluetongue virus in centinel animals

Bluetongue (BT) is an insect-transmitted viral disease of ruminant species that primarily affects sheep. This disease is caused by a virus (BTV) of the genus Orbivirus within the family Reoviridae. Twenty-six distinct serotypes of the virus have been identified to date. The rapid dissemination of the virus and the variability of the clinical signs merit the development of swift and accurate BTV detection methods, which can assist in disease control. SYBR Green-based real-time reverse transcription-PCR (rRT-PCR) assay may be an ideal method to detect rapidly the BTV genome in the blood of animals. In this study, a rRT-PCR coupled to melting curve analysis was described and compared with the nested reverse transcription-polymerase chain reaction (nRT-PCR) reported in the OIE Manual. The specificity and sensitivity of both methods were evaluated using BTV-4 RNA extracted from tenfold serially diluted tissue culture medium virus and blood (starting from 104.5 TCID50/ml). The detection limit of each test in tissue culture medium was 100.5 TCID50/ml and in blood was 101.5 TCID50/ml (rRT-PCR) and 100.5 TCID50/ml (nRT-PCR). Melting curve analysis showed that the rRT-PCR yielded curves of amplification with specific melting curves (Tm = 84°C ± 0.5°C) and absence of non-specific amplifications. The diagnostic sensibility of clinical samples from a calf under controlled conditions was evaluated. These results showed that the SYBR Green I-based real-time PCR assay is rapid, sensitive, and equally specific in the diagnosis of BT in BTV-affected animals. Key words: bluetongue virus, nested RT-PCR, SYBR Green I-based real-time RT-PCR assay. Estandarizacion de un ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR Green I para la deteccion del virus de la lengua azul en animales centinelas RESUMEN La lengua azul es una enfermedad viral de especies de rumiantes que se transmite por insectos, y que primariamente afecta a los carneros. La enfermedad es causada por un virus (BTV) que pertenece al genero Orbivirus de la familia Reoviridae. Se han identificado 26 serotipos diferentes de este virus hasta la fecha. Debido a la rapida diseminacion del virus y a la variabilidad de los signos clinicos, se necesita el desarrollo de metodos de deteccion de BTV rapidos y precisos, los cuales pueden ayudar en el control de la enfermedad. Un ensayo de RT-PCR en tiempo real (rRT-PCR), basado en SYBR Green-I, puede ser un metodo ideal para detectar rapidamente el genoma de BTV en la sangre de los animales. En este estudio se describe un analisis de curvas de disociacion acoplado al rRT-PCR y se compara con el ensayo de RT-PCR anidado (nRT-PCR) que se reporta en el Manual de la OIE. La especificidad y la sensibilidad de ambos metodos se evaluaron usando ARN de BTV-4 extraido a partir de diluciones seriadas del virus en medio de cultivo de tejido y en sangre (comenzando a partir de 104.5 TCID50/ml). El limite de deteccion de cada ensayo en medio de cultivo de tejido fue de 100.5 TCID50/ml y en sangre fue de 101.5 TCID50/ml (rRT-PCR) y 100.5 TCID50/ml (nRT-PCR). Los analisis de curvas de disociacion mostraron curvas de amplificacion con curvas de disociacion especificas (Tm = 84°C ± 0.5°C) y ausencia de amplificacion no especifica. La sensibilidad diagnostica se evaluo a partir de muestras clinicas de un ternero bajo condiciones controladas. Estos resultados mostraron que el rRT-PCR, basado en SYBR Green-I, es un ensayo rapido, sensible e igualmente especifico en el diagnostico de animales afectados con BT. Palabras clave: virus de la lengua azul, RT-PCR anidado, ensayo de RT-PCR en tiempo real basado en SYBR Green-I.