Cellular droplet microarray: a miniaturized technique for high-throughput screening of small molecules and proteins

Das Hochdurchsatz-Screening ist von groser Bedeutung und bildet einen der Eckpfeiler der aktuellen Life-Science-Research wie Biologie, Biotechnologie, Biochemie, Computerwissenschaft, medizinische Chemie und Pharmakologie. Das Interesse an einem Screening mit hohem Durchsatz unter akademischen, mittleren und kleinen Biotech-Unternehmen, staatlichen und gemeinnutzigen Screening-Standorten, sowie Auftragsforschungsorganisationen wurde spurbar erhoht, da Hochdurchsatz-Screenings eine effiziente Analyse von einer Vielzahl von Stoffen in kurzester Zeit ermoglicht. Das steigende Interesse an dieser Methode fuhrte zu einer schnellen Entwicklung von Screening-Technologien mit hohem Durchsatz in Kombination mit komplementaren Technologien. Die Nachteile herkommlicher Hochdurchsatz-Screenings beinhalten hohe Kosten und Materialverschwendung, lange Zykluszeiten, geringe Produktivitat und die begrenzte Ausbaufahigkeit der existierenden Stoffbibliotheken. Die genannten Nachteile verdeutlichen die Wichtigkeit der Bemuhungen zur Entwicklung von verbesserten miniaturisierten und automatisierten Hochdurchsatz-Screening Methoden. Droplet Microarray (DMA) ist eine dieser miniaturisierten Plattformen, welche durch die Vereinigung von Oberflachenchemie, Oberflachenfunktionalisierung und Biologie erschaffen wurde. Die hohe Tropfchendichte auf DMA senkt die Kosten, Materialverschwendung, Zykluszeit des Screenings und erhoht die Effizienz des Verfahrens, wahrend sie effektiv die Verwendung groserer chemischer und biologischer Bibliotheken unterstutzt. Die weitere Entwicklung, Auswertung und Verbesserung der DMAs spielt nicht nur fur den Fortschritt der Hochdurchsatz-Screenings eine wichtige Rolle, sondern beherbergt auch unermessliches Potential in pharmalogischen Bereichen und der Stammzellenforschung, in welcher es die Wirksamkeit von Gentransfers und das Kultivieren von undifferenzierten Stammzellen erleichtert. Pharmakologisches Priming (Drug Repurposing) wurde als adjuvante Strategie zur Verbesserung der Effizienz nicht-viraler Genubertragung angesehen. Dennoch ist die facettenreiche Anwendung des pharmakologischen Priming aufgrund der unerschwinglich hohen Kosten fur Reagenzien und die Durchfuhrung der Methode unweit verbreitet, was den aufkommenden Drang nach miniaturisierten Plattformen und Drug Repurposing erklart. Abgesehen von der Dringlichkeit im pharmakologischen Bereich, um klinisches Potenzial zu realisieren, benotigt die Stammzellenforschung auch miniaturisierte Methoden um den Einfluss von Zelloberflacheninteraktionen und Zellkulturmedium auf das Verhalten von Stammzellen und die Effekte von Zusatzstoffen, und Oberflachenbeschichtungen einschlieslich oberflachenabsorbierter Proteine auf Stammzellen zu beobachten. Das Ziel fur den ersten Teil der Dissertation war es nach kleinen Molekulen (Stoffen) auf DMAs zu suchen, welche transfektionsverstarkende Effekte beinhalten, um eine mogliche Verbesserung in den Bereichen Gentransfer- und Therapie zu bieten. Eine Untersuchung der Einflusse von 774 Food and Drug Administration (FDA)-zugelassenen Wirkstoffen auf die Transfektionseffizienz mit verschiedenen Zelltypen in miniaturisierter- und hochdurchsatzweise wurde mit Hilfe der DMAs veranlasst. Das Screening der FDA-zugelassenen Arzneimittelbibliothek identifizierte 14 einzelne Verbindungen, die eine zwei- bis funffache Verbesserung der Transfektion aufwiesen. Diese Treffer wurden verifiziert und in grosem Masstab untersucht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der auf DMA basierende Ansatz fur das Drug Repurposing bestandig ist und zur Untersuchung und Entwicklung wirksamerer nicht-viraler Genubertragungssysteme verwendet werden konnte. Das Ziel des zweiten Abschnitts der Dissertation war es, den Einfluss von Oberflacheneigenschaften und sinkendem Volumen auf die Pluripotenz von human induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) zu bestimmen. Zwei kunstliche Oberflachen mit unterschiedlichen chemischen Elementen und deren dazugehorigen DMAs wurden fur die Kultivierung und Pluripotenz von hiPSCs in vitro untersucht. Die Oberflachen und DMAs wurden genutzt, um human induzierten pluripotenten Stammzellen in 2 ml und 200 nL-Volumen zu kultivieren. Die Ergebnisse zeigten, dass hiPSCs eine hohe Lebensfahigkeit, sowie die erwartete Morphologie und Pluripotenz in 200 nL Tropfchen auf Typ A und Typ B DMAs ohne Matrigelbeschichtung nach 24 h Kultivierung aufwiesen. Dies beweist, dass DMAs eine vielseitige und simple Plattform fur kurzzeitige und xeno-freie Hochdurchsatz-Screenings von hiPSCs sind. Als Ziel fur den dritten Teil der Dissertation wurde das Identifizieren von chemisch definierten Proteinen, welche das Kultivieren und Aufrechterhalten der Plutipotenz von hiPSCs Zellen auf DMAs, sowie Mikrotiterplatten weiter verbessern konnten, angesetzt. Es ist moglich eine Proteinbeschichtung, Zellkultur und Immunfluoreszenzfarbung auf miniaturisierter Ebene parallel mit Hilfe von DMAs durchzufuhren, was zu einer Reduzierung von Versuchsfehlern und Verbrauchsmaterialien fuhrt. Auf Grund dessen wurden DMAs als Basis zur Uberprufung von elf verschiedenen Proteinen und deren verwandten binaren und ternaren Kombinationen (insgesamt 231 verschiedene Gruppen) auf ihre Fahigkeit zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs genutzt. Aus diesem Raster wurden zehn Gruppen von ternaren Proteinkombinationen identifiziert, welche die Proliferation und das Self-Renewal besser unterstutzen konnten als mit Matrigel beschichtete Oberflachen. Die effizientesten Proteinkombinationen des primaren Screenings wurden weiterhin in einer Langzeitkultur (funf Wochen) verifiziert. Zusatzlich wurde die Formation von embryonalen Korperchen der auf den ausgewahlten Proteinbeschichtungen kultivierten Zellen erzielt und es folgte die Differenzierung der hiPSCs in drei Keimblatter. Zusammengefasst, wurden DMAs als miniaturisierte Schnellscreening-Plattform verwendet, um mehrere biologische Fragen zu beantworten. Als erstes wurden 776 Wirkstoffe auf Nanoebene untersucht und somit kosten-, zeit- und arbeitssparend verwertet. Vierzehn Stoffe wiesen eine zwei- bis funffache Verbesserung der Transfektionstechniken auf. Als zweites wurden chemische Komponente von Zellkulturoberflachen und kleinen Volumina (200nl) von Zellkulturmedium gefunden, die zur Erhaltung der Pluripotenz von hiPSCs beitragen. Als letztes wurden zehn Gruppen von ternaren Proteinkombinationen identifiziert, welche das Kultivieren von undifferenzierten hiPSCs unterstutzen. Zwei von ihnen wurden weiter untersucht, um eine Langzeitkultur von undifferenzierten hiPSCs zu erzielen, gefolgt von ihrer Differenzierung in drei Keimblatter. Eine Zusammenfassung und eine Aussicht auf die Zukunft befinden sich am Ende der Dissertation.