苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32(Cry2Ab32)基因的克隆、表达与杀虫活性分析

为了扩充新的鳞翅目杀虫蛋白基因,本研究采用限制性片段长度多态性PCR（PCR-restricted fragment length polymorphisms,PCR-RFLP）方法对苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株BN23-5中所含杀虫晶体蛋白基因进行鉴定和分析。结果表明,该菌株中含有晶体蛋白（crystal,cry）cry2Ab类基因。根据已知cry2Ab类基因编码区设计简并引物,以菌株BN23-5全质粒DNA为模板进行扩增并测序。结果显示,扩增产物为一个完整的cry2Ab类基因,全长1 902 bp,由634个氨基酸组成,氨基酸序列与Cry2Ab1同源性最高（96.5%）,命名为cry2Ab32（Gen Bank登录号：KJ710647）。将该基因插入表达载体p ET-28a,构建重组质粒p ET-2Ab并转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）,异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导成功表达蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）验证其相对分子质量为65 k D左右。表达的包涵体蛋白采用饲喂法进行生物活性测定,结果表明,Cry2Ab32对小菜蛾（Plutella xylostella）、玉米螟（Ostrinia fumacalis）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）均有杀虫活性,半致死浓度（median lethal concentration,LC50）分别为8.99、19.34和21.24μg/m L,对甜菜夜蛾（Laphygma exigua）的致死率不高,但能明显抑制甜菜夜蛾的生长。cry2Ab32新基因的发现将为重要农业害虫的防治提供更多选择,为进一步研究Cry2Ab类蛋白结构和杀虫机理提供基础资料。