[60]Fullerène et dérivés : critères de pureté et impact fonctionnel in vivo sur les mitochondries, in vitro et ex vivo sur les cellules de l’allergie

En 1985 Kroto decrit le troisieme allotrope du carbone, le fullerene, une sphere de 60 carbones d’1nm de diametre aux caracteristiques physico-chimiques particulieres. La reactivite chimique du C₆₀ est dominee par les reactions d’addition et sa grande affinite pour les radicaux libres grâce a ses 30 double-liaisons. Cette propriete a ete exploree dans le stress oxydant, tant in vitro qu’in vivo, ou l’equilibre redox est implique, comme dans les situations pathophysiologiques impliquant l’inflammation et la degenerescence cellulaire. En particulier, un traitement au C₆₀ solubilise dans de l’huile a permis de prolonger l’esperance de vie chez le rat. Le produit, commercialise a travers le monde, n’a pas encore fait l’objet d’essai clinique. D’autre part certaines preparations peuvent contenir des impuretes. Il est donc important d’etablir des criteres de purete et d’integrite des preparations de C₆₀. Ce travail de these comporte deux parties. La premiere, physicochimique, nous a permis d’evaluer la purete de preparations commerciales de C₆₀ de differentes origines faisant appel a differentes techniques d’analyse: microscopie electronique a balayage, diffraction aux rayons X, calorimetrie differentielle a balayage (DSC), analyse thermogravimetrique, chromatographie liquide (CLHP) ou en phase gazeuse couplee a la spectrometrie de masse (CG-SM), ainsi que la spectroscopie ultraviolet-visible ou infrarouge a transformee de Fourier (FTIR). La DSC est la technique de choix pour etablir le critere de purete et la FTIR la plus rapide. La CG-SM est necessaire a l’identification des impuretes volatiles, tandis que la CLHP permet de detecter les fullerenes lourds et les derives du C₆₀. La deuxieme partie a porte sur des aspects fonctionnels des fullerenes et nous avons, pour cela, utilise des preparations pures selon les criteres definis precedemment. Dans un premier temps, nous avons cherche a preciser le sous-compartiment cellulaire cible par le C₆₀ injecte in vivo chez la souris. Apres administration d’une solution huileuse, les molecules de C₆₀ sont retrouvees dans le foie et la rate, a l’interieur des cellules, parfois au niveau des mitochondries et du reticulum endoplasmique. La presence des molecules de C₆₀, au niveau des mitochondries a ete corroboree par la mise en evidence de modifications specifiques d’activite des enzymes de la mitochondrie (malate deshydrogenase et complexe I de la chaine respiratoire). Dans un deuxieme temps, nous avons aborde l’effet des fullerenes sur des cellules intervenant dans une dysregulation immunologique ou l’inflammation joue un role important : l’allergie. L’evenement cellulaire a l’origine des symptomes allergiques est la liberation de mediateurs de l’inflammation et de la reponse immunitaire lors de l’activation dependante des IgE des basophiles et des mastocytes. L’effet regulateur de C₆₀ et de quatre derives hydrosolubles, le fullerol, la β-cyclodextrine C₆₀, le dendro C₆₀ et le C₆₀ serinol-malonate, a ete teste. L’innocuite des derives a des concentrations nanomolaires et leur pouvoir inhibiteur sur la degranulation IgE et non IgE dependante des lignees mastocytaires de rat a ete verifie in vitro. Dans un test d’activation cellulaire mesurant l’expression des marqueurs CD63 et CD203c par cytometrie de flux, nous montrons que les differents derives sont capables d’interferer ex vivo avec l’activation de basophiles de patients allergiques dans des conditions naturelles de sang total. Les taux d’inhibition dependent des derives et des patients avec un maximum observe a 35% en presence de C₆₀ serinol-malonate. Ces inhibitions ont ete reproduites sur des basophiles humains purifies en etudiant des marqueurs d’activation supplementaires CD107a et CD69. Les perspectives de ce travail portent sur la specificite et les mecanismes d’inhibitions observes au niveau intracellulaire. Elles incluent, par exemple, l’etude des flux de calcium ou des proteines de fusion, ou des facteurs de transcription.