重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING，并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体，为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL，抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物，扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域，通过重组PCR，将SH2分别与U—box、RING进行融合，融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4，经过酶切鉴定及测序后，转染HEK293T细胞，Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp，SH2一RING大小为633bp，重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确，转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING，转染HEK293T细胞后能够正确表达，为后续研究奠定了基础。