磷酸化Akt1（Thr308）位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的：构建磷酸化Akt1（Thr308）位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测。方法：以带有pc DNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1（T308A）（苏氨酸突变成丙氨酸）、Akt1（T308E）（苏氨酸突变成谷氨酸）位点突变编码区序列,将其插入pc DNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和m RNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响。结果：双酶切和测序结果表明Akt1（T308A）、Akt1（T308E）的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/c DDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1（T308A）可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1（T308E）升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1（T308A）较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1（T308E）促进耐药细胞生长。结论：PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用。