EXPRESSÃO DA TRIPANOTIONA REDUTASE DE L. braziliensis PARA BUSCA DE NOVOS INIBIDORES

A leishmaniose e uma doenca negligenciada que afeta populacoes pobres e que e causada por protozoarios flagelados do genero Leishmania . A terapia baseia-se principalmente na utilizacao de antimoniais pentavalentes e seus derivados ha decadas, embora ate o momento, os mecanismos de acao especificos destes medicamentos ainda sejam desconhecidos. O desenvolvimento de novos farmacos com acao especifica contra o parasita e fundamental para o estabelecimento de novas terapias.  Esta especificidade pode ser atingida estudando alvos metabolicos unicos destes protozoarios, como a tripanotiona redutase, uma enzima envolvida na cascata de oxido-reducao dos radicais livres produzidos nos macrofagos, como mecanismo de defesa durante a infeccao. Este trabalho tem como objetivos a expressao do alvo tripanotiona redutase de Leishmania braziliensis em bacterias Escherichia coli , purificacao, teste de atividade enzimatica e posterior teste contra diversos compostos isolados e caracterizados a partir de extratos vegetais e venenos de anuros e serpentes da biodiversidade amazonica. Para tanto, serao utilizadas tecnicas de cromatografia, espectrometria de massas e ressonância plasmonica de superficie. Ate o momento foi realizada a expressao em E. coli BL21(DE3) mediante transformacao com o vetor sintetico pET28 a (+) contendo a sequencia de interesse. Posteriormente realizou-se purificacao por cromatografia em HPLC, utilizando uma coluna de afinidade de niquel, padronizando as condicoes de eluicao da coluna com tampao contendo 350 mM imidazol, 210 mM de NaCl, 35 mM de NaH 2 PO 4 . A quantificacao e calculo de rendimento foram realizados obtendo-se como resultado 6 mg/L de proteina recombinante expressa. O ensaio de atividade revelou que a enzima foi expressa e purificada como uma enzima ativa e, quando utilizada a 200 ng, manteve uma relacao linear (r=0,9984) e ΔAbs de 0,012/min. Nas seguintes etapas do trabalho espera-se realizar analises da massa relativa da molecula e do ponto isoeletrico, por espectrometria de massas e gel 2D SDS-PAGE respectivamente. Seguidamente, analises in silico de docking molecular do alvo contra os potenciais inibidores serao realizados, como tambem ensaios de atividade inibitoria e ressonância plasmonica de superficie contra as moleculas que apresentem melhores resultados no teste in silico . Posteriormente serao realizados testes in vitro contra o parasita.