Isolierung und Strukturaufklärung von Bioaktiven Sekundärmetaboliten aus dem Schwamm Assoziierten Pilz Aspergillus sp.

Marine Mikroorganismen haben sich als ergiebige Quelle von strukturell interessanten und biologisch aktiven Naturstoffen erwiesen. Insbesondere haben marine Pilze die Aufmerksamkeit auf sich gezogen durch die Diversitat an chemischen Inhaltsstoffen und beobachteten biologischen Aktivitaten ihrer sekundaren Metaboliten. Marine Pilze wurden aus verschiedenen Organismen isoliert, einschlieslich Algen, Muscheln und im besonderen, Schwammen. Jedoch erwiesen sich schwammassoziierte Pilze als produktivste Quelle fur bioaktive Stoffe. Zudem zeigten die meisten Substanzen aus schwammassoziierten Pilzen eine signifikante Biokativitat in einigen pharmakologischen Bioassay Projekten. Daher konnten diese interessante Kandidaten sein, um Leitstrukturen fur die Entwicklung neuer Pharmaka, primar auf dem Feld der Zytostatika, Entzundungshemmer, Antiinfektiva und Analgetika, bereitzustellen. Folglich war es das Ziel dieser Arbeit, sekundar Metabolite aus dem marinen Pilz Aspergillus sp., isoliert aus dem mediterranem Schwamm Tethya auratium, zu identifizieren und auf das pharmakologische Potential zu untersuchen. Die Groskultivierung des Pilzen zur Isolierung und Identifizierung von Sekundarmetaboliten wurde auf zwei unterschiedlichen Medien durchgefuhrt, und zwar auf Bio-Malz Agar und festem Dinkel-Gerste Medium fur 21 Tage bei 22°C. Die von beiden Medien gewonnen Kulturen wurden lyophilisiert, mit Ethylacetat extrahiert und der nach dem Abroutieren zuruckbleibende trocken Ruckstand mit Petrolether entfettet. Die daraus resultierende Fraktion wurde anschliesend unterschiedlichen chromatographischen Separierungsverfahren zugefuhrt um die Sekundarmetabolite zu isolieren. Zur Identifikation von Molekulargewicht und Struktur der Sekundarmetabolite wurden in erster Linie Verfahren der Massenspektrometrie (MS) und der Magnetresonanz-Experimente (NMR) verwendet. Zudem wurde in Einzelfallen, bei optisch aktiven Naturstoffen, eine Time-dependent Density Funcional Theory Electronic Circular Dichroism (TDDFT ECD) Berechnungen durchgefuhrt um deren absolute Konfiguration festzustellen. Schlieslich wurden alle isolierten Substanzen unterschiedlichen Bioassays zugefuhrt, wie z.B. Zytotoxizitats- und antimikrobiellen Assays, um deren Bioaktivitat festzustellen. Die chromatographische Auftrennung des Rohextraktes vom schammassoziiertem Pilz Aspergillus sp. ergab elf bekannte Polyketide (1-7, 16-18, und 28), sechs neue Meroterpenoide (10-14 und 29), zwolf Alkaloide einschlieslich einem neuen Thyotoquivalin (20), sechs neue Fumiquinazolone (21-26), ein neues Tryptophan-Alkaloid (31) als auch vier bekannte Alkaloide (8, 9, 19, und 27), einen neuen Biphenylether (30) und ein bekanntes Nukleosid (15). Bei den meisten in dieser Studie isolierten Polyketiden waren Citrinin-Derivate. Zusatzlich wurde Butyrolacton II (1) als Hauptsekundarmetabolit des untersuchten Aspergillus sp. isoliert. 4-Acetyl-3,4-dihydro-6,8-dihydroxy-5-methyl Isocoumarin (5) zeigte eine ausgepragte Zytotoxizitat gegen mehrere ausgewahlte Zelllinien, wohingegen alle anderen Polyketide keine oder eine nur sehr schwache Aktivitat gegen die murine Lymphomzellline L5178Y zeigte. Die unbekannten meroterpenoiden Substanzen, Austalide M-R (10-14 und 29), zeigten sich strukturell verwandt mit den bekannten Austaliden A-L, welche zuvor aus Aspergillus ustus isoliert wurden. Die strukturelle Analyse der Austalide legt einen Biosyntheseweg nahe, welcher 6-Farnesyl-5,7-dihydroxy-4-methylphtalid enthalt, ein wichtiges Zwischenprodukt in der Biogenese von Mycophenolsaure. Daruber hinaus wurden TDDFT ECD Berechnungen der Austalide M-Q (10-14), neue Metabolite von Aspergillus sp., vorgestellt. ECD Berechnungen gaben Aufschluss uber die absolute Konfiguration und zeigten zudem, dass die Konformation des Chromophors, wie auch der charakteristische ECD-Cotton Effekt im benzylischen Zentrum, durch das Phtalid bestimmt wird. Die Berechnungen erklarten auserdem die bemerkenswerten Unterschiede der ECD-Spektren der strukturell verwandten Austalide und zeigen, dass die absolute Geometrie nicht durch einen einfachen Vergleich von ECD-Spektren ermittelt werden kann. Letztendlich zeigten diese Verbindungen jedoch nur eine schwache, oder keine Aktivitat gegenuber der murinen Lymphomzelllinie L5178Y. Die bekannten Alkaloide 8, 9 und 19 wurden zum ersten Mal aus einem schwammassoziierten Pilz charakterisiert, wahrend in fruhere Studien bereits die Isolierung von Aspergillus fumigatus aus Meeressediment, Aspergillus fumigatus aus der Raumluft von Asthma-Patienten und Trichoderma sp. aus Bambusblattern beschrieben wurde. Verbindung 8 und 9 zeigten eine ausgepragte Zytotoxizitat gegen die Mauslymphomzelllinie L5158Y mit IC50 Werte von 3,7 und 0,2 µM, wahrend 19 nur eine schwache Aktivitat in diesem Assay zeigte. Daruber hinaus zeigte 9 getestet auf menschlichen Zelllinien, eine moderate Aktivitat gegen ovariale Karzinomzellen (A2780sens) und die Philadelphia Chromosom positive, chronische myeloische Leukamie Zelllinie (K562) mit IC50 Werten zwischen 8,0 und 19,3 µM, wahrend 8 nur eine moderate bis schwache Aktivitat gegenuber K562, A2780sens und A2780CisR mit IC50 Werten von 15,0, 18,5 und 38,8 µM zeigte. Die Verbindungen 20-26 sind neue Tryptoquivaline- und Fumiquinazolonalkaloide. Die wichtigsten strukturellen Unterschiede zwischen denen in dieser Studie neu erfassten Vertretern und den bereits zuvor beschriebenen Verbindungen mit gleichem molekularem Gerust, ist die Einbeziehung eines seltenen Aminosaurerests, 1-Aminocyclopropan-1-carbonsaure, anstelle von Alanin- oder Methylalaninresten, wie es in den fruher berichteten Analoga zu finden ist. Die absolute Konfiguration von Tryptoquivalin K (20) und Fumiquinazolon K (21) wurde durch TDDFT ECD Berechnungen der Losung ihrer Konformere untersucht und die ECD letzterer wurden auch verwendet um eine strukturelle Abgrenzung der verwandten Fumiquinazolone L-P (22-26) vorzunehmen. Auserdem wurden die neuen Alkaloide (20-26) bezuglich ihrer Zytotoxizitat mittels der murinen Lymphomkarzinoms L5178Y uberpruft, wo sie nur eine schwach bis keine Aktivitat zeigten (bis zu einer Dosis von 10 µg/ml) Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Studie einunddreisig Verbindungen erfolgreich aus dem schwammassoziieren Pilz Aspergillus sp. identifiziert wurden, von den funfzehn nach unserem besten Wissen, neue Naturstoffe sind (Tabelle 5.1).