Etude de la hiérarchie de sécrétion des effecteurs de virulence chez Shigella flexneri

Shigella provoque la dysenterie bacillaire en envahissant les muqueuses du colon. Cette maladie diarrheique est responsable d’un million de deces par an essentiellement dans les pays en voie developpement. Les genes necessaires al’entree dans les cellules hotes sont regroupes sur un fragment d’ADN plasmidique de 30-kb. Celui-ci contient deux types de genes, les genes ipa(B, C et D) et ipgcodant pour des proteines responsables de l’entree de la bacterie dans les cellules, et les genes mxi/spacodant pour un systeme de secretion appeletype III (SST3) necessaire ala secretion des facteurs de virulence. Les genes mxi/spaetipa/ipgsont exprimes a37°C et les proteines Ipa/Ipgrestent dans le cytoplasme jusqu’ace que le SST3 soit activeau contact de la cellule hote. Ce contact induit l’internalisation de la bacterie par macropinocytose, suivie de sa dissemination intra-et intercellulaire. Des observations en microscopie electronique (ME) montrent que le SST3 est composede trois parties: i) une aiguille dont la longueur est regulee a50 nm par la proteine Spa32, ii) un corps basal qui traverse les membranes interneet externe ainsi que le peptidoglycane, et iii) un bulbe cytoplasmique. Le SST3 est le dispositif principal de virulence et permet l’injection de facteurs de virulences du cytoplasme bacterien vers celui de la cellule cible. Shigelladoit secreter ces proteines de maniere ordonnee. Tres peu de travaux ont abordecette question. L’objectif principal de ce travail de these a eted’etudier les mecanismes moleculaires impliques dans la hierarchie de secretion.Nous avons principalement investiguele role de 3 proteines: Spa32, Spa40 et MxiC dans la secretion. Nous avons montre, par des etudes genetiques, que contrairement aux etudes publiees sur les proteines homologues, Spa32 n’agit pas comme un «molecularruler»pour reguler la taille de l’aiguille. Nous avons montreque cette regulation necessite l’interaction de Spa32 via ses residus 206-246 au domaine C-terminal de Spa40 (Spa40C) (Botteaux et al., 2008a). Ayant identifiecette interaction avec Spa40, l’etape suivante de notre travail a portesur la caracterisation de la fonction du gene spa40par des methodes genetique, biochimique et structurale (ME). Nos resultats montrent que Spa40 joue un role important dans l’assemblage du SST3. Des plus, nous avons mis en evidence de nouvelles interactions impliquant Spa40C et des composants du SST3 (Botteaux et al., in preparation).Parallelement aces travaux, nous avons montreque l’inactivation du gene mxiCaboutit aune deregulation specifique de la secretion des effecteurs sans alterer celle des translocateurs IpaB et IpaC. Cette augmentation de secretion est due aune augmentation de transcription des genes tardifs, consequence de la secretion precoce de l’anti-activateur transcriptionnel, OspD1 (Botteaux et al., 2008b). De plus, nous avons montreque MxiC est un substrat de l’appareil de secretion et que cette secretion est associee asa fonction. Finalement, la mise en evidence d’une interaction entre MxiC et Spa47, l’ATPase du SST3 nous permet de proposer un modele regulant la hierarchie de secretion des effecteurs.Dans une autre partie de notre travail, nous avons identifie, par des experiences de ME et d’immunomarquage, que l’invasineIpaD est localisee au sommet de l’aiguille du SST3 ouelle lui sert de bouchon. Enfin, de maniere tres interessante, nous avons montreque des anticorps anti-IpaD neutralisent l’entree de Shigelladans les cellules (Sani, Botteaux et al., 2007, depot de brevet). IpaD, etant conservee dans les isolats invasifs de Shigella, represente donc un reel candidat vaccinal pouvant pallier la diversitedes serotypesbacteriens.En conclusion, nos travaux representent une contribution importante ala comprehension des mecanismes de virulence bacteriens et depassent le cadre de Shigellapuisque les systemes de secretion sont hautement conserves parmi plusieurs pathogenes. L’identification de drogues pouvant interferer avec ces systemes de secretion represente une voie d’avenir pour le developpement de nouveaux agents anti-infectieux.