重组人纤溶酶原Kringle 1-5的制备及其生物学活性

为了研究重组人纤溶酶原Kringle1-5(K1-5)的抗血管生成活性及其对内皮细胞增殖的影响,通过PCR扩增人纤溶酶原K1-5 cDNA,定向克隆于原核表达载体pET30a(+)中,构建重组表达载体pET-K1-5,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western杂交检测K1-5的表达.鸡胚尿囊膜(CAM)实验和MTT实验分别检测重组人纤溶酶原Kringle1-5对鸡胚新生血管生成和内皮细胞的抑制作用.结果表明,IPTG诱导原核表达载体pET-K1-5在E.coli BL21(DE3)中的表达量约占菌体总蛋白量的32%,K1-5主要以包涵体形式存在,包涵体经过洗涤、溶解、Ni-spin亲合柱层析纯化以及蛋白质复性等步骤后,获得了纯度约为96%的重组K1-5蛋白.CAM实验表明,原核表达的重组人K1-5能有效地按剂量依赖的方式抑制鸡胚新生血管的形成.MTT实验结果显示,重组人K1-5特异地抑制内皮细胞的增殖,而对非内皮细胞无抑制作用.