Proteinase Inhibitor in Lamb Meconium and Faeces (LMPI) Purification, Pattern of Inhibition and In vivo Experiments

ummary A considerable amount of trypsin inhibitor (LMPI) was found in lamb meconium, especially in the first lot passed, from which 1 g. (wet weight) was able to inhibit the activity of up to 7 mg. trypsin. The inhibitor was also detected in the faeces of suckling lambs, although in a one order lower concentration (0.5–1.0 mg./g. wet weight). The inhibitor content of the faeces tended to decrease with advancing age and disappeared altogether by 40–50 days. LMPI was also detected in the faeces of colostrum-deprived lambs reared artificially on a trypsin-inhibitor-free milk substitute. The cessation of its excretion seemed to depend on the age of the lamb rather then on its diet. Intestinal trypsin activity ceased at the ileo-caecal valve at all ages, but the trypsin inhibitor appeared in the anterior large intestine in the suckling lambs only. LMPI purified by affinity chromatography was very resistant to acid and heat. Its inhibition pattern covered trypsin, alpha-chymotrypsin, elastase and subtilisin. Purification did not alter the inhibition pattern. Analysis by gel chromatography disclosed a considerable heterogeneity of the inhibitor in respect of molecular size. The proteinase inhibitor(s) associated with lamb meconium and faeces displayed similar characteristics and differed from all known proteinase inhibitors in respect of their inhibition pattern and/or resistance to acid and heat. LMPI is probably secreted by the large intestinal mucosa, but this remains to be substantiated by experimental evidence. Its physiological role is not known. Zusammenfassung Proteaseinhibitor im Mekonium von Sauglammern Reinigung, Wirkungsweise, Tierversuche Das Mekonium der Lammer enthalt grose Mengen von Proteinaseinhibitor (LMPI), besonders das erste Mekonium, das Trypsinmengen bis 7 mg/g hemmen kann. Der Inhibitor ist auch im Kot von entwohnten Lammern nachgewiesen worden, seine Konzentration war aber um eine Grosenordnung kleiner (0,5–1,0 mg/g Frischmenge), als im Mekonium. Der Inhibitor-Gehalt des Kotes fallt mit fortschreitendem Alter der Tiere ab und verschwindet ungefahr am 40.–50. Lebenstag vollkommen. LMPI ist auch im Kot von Lammern, die ohne Kolostrum mit Inhibitor-freien Milchaustauschern aufgezogen wurden, vorhanden. Das Aufhoren der Inhibitorexkretion scheint vom Lebensalter und nicht von der Diat abzuhangen. An der Ileozakalklappe verschwindet die Trpysinaktivitat bei den Tieren jeden Alters, der Inhibitor erscheint aber nur im proximalen Dickdarm der Sauglammer. LMPI, welcher aus dem Mekonium mittels Affinitats-Chromatographie gereinigt wurde, ist gegen Saure und Warme sehr resistent. Auser Trypsin vermag er auch α-Chymotrypsin, Elastase und Subtilisin zu hemmen. Das Hemmungsspektrum blieb wahrend der Reinigung unverandert. Bei Gelchromatographie erwies sich der Inhibitor als sehr heterogen. LMPI zeigt gleiche Eigenschaften wie der Inhibitor des Kotes; aber aufgrund des Hemmungsspektrums und/oder der Stabilitat scheinen sich diese Inhibitoren von allen bisher bekannten Proteinaseinhibitoren zu unterscheiden. LMPI wird wahrscheinlich von der Dickdarmschleimhaut sezerniert. Sine physiologische Bedeutung bleibt noch aufzuklaren. Resume Inhibiteur de protease dans le meconium d'agneaux Purification, mode d'action, essai biologique Le meconium des agneaux contient une grande quantite d'inhibitor de protease (LMPI), particulierement dans le premier meconium qui peut inhiber une quantite de trypsine pouvant aller jusqu'a 7 mg/g. L'inhibiteur a egalement ete mis en evidence dans les feces d'agneaux sevres; sa concentration etait dans un ordre de grandeur de 0,5–1,0 mg/g plus faible que dans le meconium. Le taux de l'inhibiteur dans les matieres fecales diminue avec l'âge des animaux pour disparaitre totalement vers le 40e–50e apres la naissance. LMPI existe egaelement dans les feces des agneaux qui ont ete eleves sans colostrum avec un succedanne lacte sans inhibiteur. La cessation de l'excretion de l'inhibiteur semble dependre de l'âge et non du regime alimentaire. L'activite trypsinique disparait a la valvule ileocaecale chez les animaux de tout âge, l'inhibiteur n'apparaissant que dans la partie proximale du gros intestin des agneaux a la mammelle. LMPI purifie a partir du meconium au moyen de la chromatographie par affinite, est tres resistant envers l'acidite et la chaleur. LMPI inhibe egalement au plus de la trypsine, α-chymotrypsine, elastase et subtilisine. Le spectre d'inhibition reste inchange durant la purification. L'inhibiteur s'est revele tres heterogene lors de chromatographie sur gel. LMPI presente les memes proprietes que l'inhibiteur des matieres fecales; mais sur la base du spectre d'inhibition et/ou de la stabilite, ces inhibiteurs semblent se differencier de tous les inhibiteurs de proteinase connus jusqu'a maintenant. LMPI est probablement secrete par la paroi du gros intestin. La signification physiologique reste encore a determiner. Resumen Inhibidor de la proteasa en el meconio de corderos lactantes Su purificacion, modo de obrar y experimentos con animales El meconio de corderos contiene cantidades grandes de inhibidor de la proteinasa (LMPI), sobre todo el primer meconio, pudiendo inhibir 1 g. del mismo hasta 7 mg. de tripsina. Tambien se ha identificado el inhibidor en las heces de corderos destetados, pero su concentracion era menor en un orden dimensional (0.5–1.0 mg./g. cantidad fresca) que en el meconio. El contenido en inhibidor del estiercol disminuye al aumentar la edad de los animales, desapareciendo por completo hacia el dia 40°–50° de vida. LMPI tambien se encuentra presente en el estiercol de corderos que se recriaron sin calostro con substitutos de leche libres de inhibidor. El cese de excrecion del inhibidor parece depender de la edad y no de la dieta. En la valvula ileocecal desaparece la actividad de la tripsina en los animales de todas las edades, en cambio solo aparece el inhibidor en el intestino grueso proximal de los corderos lactantes. LMPI, purificado a partir del meconio mediante cromatografia de afinidad, es muy resistente frente al acido y al calor. Ademas de la tripsina, tambien es capaz de inhibir α-quimotripsina, elastasa y subtilisina. El espectro de inhibicion no se altero por la purificacion. En el analisis por cromatografia en gelosa se mostro el inhibidor como muy heterogeneo con respecto al tamano molecular. LMPI presenta las mismas propiedades que el inhibidor de las heces; pero a la vista del espectro de inhibicion y/o de la estabilidad parecen diferir estos inhibidores de todos los inhibidores conocidos hasta la fecha. LMPI es secretado probablemente por la mucosa del intestino grueso. Queda por descubrir su significacion fisiologica.