Papel de la fosforilación de p27 en la serina 10 en la función endotelial y el remodelado vascular patológico

El supresor tumoral p27 ha sido ampliamente implicado en multitud de procesos patologicos donde ejerce un papel protector debido a su accion antiproliferativa. Particularmente, a nivel cardiovascular, nuestro laboratorio ha demostrado que p27 protege frente al desarrollo de aterosclerosis en modelos murinos gracias a su funcion anti-proliferativa (1, 2). La regulacion de p27 esta fuertemente mediada por sus modificaciones postraduccionales, entre las que destaca su fosforilacion en la serina 10 (principal modificacion que sufre la proteina). Recientemente, nuestro laboratorio ha demostrado que la fosforilacion de p27 en su Ser10 protege frente al desarrollo de aterosclerosis avanzada, incrementando la susceptibilidad de los macrofagos para captar lipoproteinas modificadas sin afectar la proliferacion celular en la pared arterial (3). Este resultado se suma a recientes estudios que demuestran la participacion de esta proteina en otros procesos independientes del control del ciclo celular (4-8) e invita a profundizar en el papel que juega la fosforilacion de p27 en serina 10 en el contexto vascular. En este trabajo hemos querido profundizar en los mecanismos por los que dicha fosforilacion afecta a la formacion de aterosclerosis (centrandonos en sus primeros estadios), asi como identificar otros procesos patologicos en el sistema vascular en los que podria intervenir (formacion de aneurismas, contractibilidad vascular etc.). Para la consecucion de estos objetivos se utilizaron diferentes estrategias experimentales basada en modelos in vitro e in vivo, algunos de las cuales se detallan a continuacion. El estudio se ha basado de manera sustancial en la utilizacion de modelos animales. El mas importante fue el raton p27S10A, el cual expresa una version mutada de p27 en la que se sustituyo la Serina en posicion 10 (susceptible de fosforilacion) por una Alanina (residuo incapaz de sufrir dicha modificacion). Este raton nos ha permitido estudiar las consecuencias fisiologicas, celulares y moleculares de un estado desfosforilado de la serina 10 de p27. Con el proposito de estudiar el proceso aterosclerotico nos hemos valido del raton deficiente en apolipoproteina E, capaz de desarrollar aterosclerosis de manera acelerada en condiciones de dieta hipercolesterolemica. Por otro lado, con el objetivo de analizar las interacciones leucocito-endotelio caracteristicas de las primeras fases de la enfermedad, hemos recurrido a tecnicas de microscopia intravital que han permitido la visualizacion in vivo de arterias de raton. Estas tecnicas tambien se emplearon para el estudio de la capacidad contractil en arterias de pequeno tamano. Ademas, estos experimentos se complementaron con estudios ex vivo en vasos de mayor calibre mediante el empleo de un miografo de alambre. Por ultimo destacar la utilizacion del modelo de infusion de AngII en ratones deficientes en apolipoporteina E, para la generacion y el estudio de aneurismas aortico-abdominales. Todos estos ensayos fueron completados con estudios in vitro de celulas en cultivo y el empleo de tecnicas de biologia molecular (Western-blot, qPCR, ELISA, etc.). Se observo que la regulacion de la fosforilacion de p27 en la serina 10 juega un papel muy importante en la homeostasis vascular, particularmente a nivel endotelial. En estudios de aterosclerosis hemos visto que se produce un descenso en el nivel de fosforilacion de p27 en serina 10 en aorta y que la ausencia de esta fosforilacion promueve la activacion endotelial y el posterior reclutamiento leucocitario. Esto es consecuencia de una hiperactivacion de la ruta de senalizacion RhoA-ROCK que desencadena un aumento en la expresion de VCAM-1, molecula de adhesion endotelial. Como consecuencia de estas acciones a nivel celular, el estado defosforilado de p27 promueve in vivo la formacion de aterosclerosis desde las primeras etapas de la enfermedad. Profundizando en el estudio del endotelio, se observo que esta fosforilacion tambien modula la regulacion del tono vascular. Experimentos tanto ex vivo como in vivo demostraron que la ausencia de dicha fosforilacion incrementa la contractilidad vascular de un modo dependiente de endotelio. Este hallazgo se asocio a un aumento de la expresion de la proteina COX-2 en celulas endoteliales de aorta de raton. Estudios complementarios demostraron que la inhibicion especifica de COX-2 era suficiente para que la ausencia de fosforilacion de p27 no modificase el patron contractil observado en aortas control. Ademas, observamos que los ratones que carecian de la forma fosforilada de p27 no presentaban hipertension arterial pero si mostraron alteraciones en la estructura de la pared vascular. Por ultimo, el incremento de la expresion de COX-2 y la modificacion estructural de las arterias debido a la ausencia de fosforilacion de p27 en serina 10 se tradujo en un incremento del riesgo a sufrir aneurismas de aorta abdominal. Esta enfermedad, que comparte ciertas caracteristicas con la aterosclerosis, se desarrollo en mayor grado en ratones p27S10A al compararlos con sus controles silvestres. Del mismo modo, este fenotipo se debio a una mayor actividad de la enzima COX-2 en aorta, hecho que se confirmo con experimentos en los que se bloqueo especificamente la actividad de la enzima. Los resultados obtenidos muestran que la fosforilacion de p27 en la serina 10 regula un gran numero de procesos implicados en la patologia vascular. Por un lado se demostro que la importancia de esta fosforilacion en el desarrollo de aterosclerosis no solo se limita a estados avanzados de la misma,como ya se vio en estudios previos (3), sino que, mediante el control de la funcion endotelial, tambien es relevante en el inicio del proceso aterosclerotico. Este hallazgo apunta a p27 como una posible diana para la prevencion de la aterosclerosis, debido a su papel importante durante todo el proceso patologico. Asimismo, la identificacion de esta fosforilacion como factor en la regulacion de la expresion de COX-2 a nivel endotelial y las consecuencias que de ello se derivaron (mayor predisposicion a la formacion de aneurismas y aumento de la reactivada vascular) invitan a seguir profundizando en el estudio de esta proteina. Entre los retos aun por afrontar se encontraria sin duda la identificacion de las quinasas y/o fosfatasas especificas que regulan el estado fosforilativo de la proteina, asi como los estimulos que las inducen, como punto de partida hacia futuras terapias. Bibliografia: 1. Diez-Juan A, Andres V. The growth suppressor p27Kip1 protects against diet-induced atherosclerosis. FASEB J. 2001 September 1, 2001;15(11):1989-95. 2. Diez-Juan A, Perez P, Aracil M, Sancho D, Bernad A, Sanchez-Madrid F, et al. Selective inactivation of p27Kip1 in hematopoietic progenitor cells increases neointimal macrophage proliferation and accelerates atherosclerosis. Blood. 2004 January 1, 2004;103(1):158-61. 3. Fuster JJ, Gonzalez-Navarro H, Vinue A, Molina-Sanchez P, Andres-Manzano MJ, Nakayama KI, et al. Deficient p27 phosphorylation at serine 10 increases macrophage foam cell formation and aggravates atherosclerosis through a proliferation-independent mechanism. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011 Nov;31(11):2455-63. 4. Besson A, Gurian-West M, Schmidt A, Hall A, Roberts JM. p27Kip1 modulates cell migration through the regulation of RhoA activation. Genes Dev. 2004 April 15, 2004;18(8):862-76. 5. Castro C, Diez-Juan A, Cortes MJ, Andres V. Distinct regulation of mitogen-activated protein kinases and p27Kip1 in smooth muscle cells from different vascular beds. A potential role in establishing regional phenotypic variance. J Biol Chem. 2003 Feb 14;278(7):4482-90. 6. Diez-Juan A, Andres V. Coordinate control of proliferation and migration by the p27Kip1/Cyclin-Dependent Kinase/Retinoblastoma pathway in vascular smooth muscle cells and fibroblasts. Circ Res. 2003 March 7, 2003;92(4):402-10. 7. McAllister SS, Becker-Hapak M, Pintucci G, Pagano M, Dowdy SF. Novel p27kip1 C-terminal scatter domain mediates Rac-dependent cell migration independent of cell cycle arrest functions. Mol Cell Biol. 2003 January 1, 2003;23(1):216-28. 8. Pippa R, Espinosa L, Gundem G, Garcia-Escudero R, Dominguez A, Orlando S, et al. p27Kip1 represses transcription by direct interaction with p130/E2F4 at the promoters of target genes. Oncogene. 2012 Sep 20;31(38):4207-20.