Struktur-basiertes Protein Engineering von neuen Penicillin G Acylasen aus Gram-positiven Bakterien für innovative biotechnologische Anwendungen

Penicillin G Acylasen (PGAs) sind Schlusselenzyme fur die biotechnologische Herstellung von semi-synthetischen s-Lactam-Antibiotika. Neben der industriell verwendeten, aber wenig thermostabilen PGA aus E. coli wurden in dieser Arbeit neuartige PGAs aus Bacillus spp. durch Datenbanksuche identifiziert. Diese wurden mit B. megaterium erfolgreich produziert, sekretiert und experimentell als aktive PGAs bestatigt. Zwei neuartige PGAs aus B. thermotolerans (BtPGA) und B. sp. FJAT-27231 (FJAT-PGA) wiesen mit 64,5 und 73,3 °C um bis zu 16,5 °C gesteigerte Thermostabilitaten gegenuber der PGA aus B. megaterium (BmPGA) auf. Die Proteinstrukturen der heterodimeren Bm-, Bt- und FJAT-PGA wurden als erste Strukturen von PGAs aus Gram-positiven Bakterien aufgeklart. Auf dieser Grundlage wurden Hybrid-PGAs, die aus Untereinheiten verschiedener Spezies bestehen, und Single-chain PGAs, bei denen die beiden Untereinheiten durch einen artifiziellen Linker kovalent verbunden wurden, erfolgreich produziert, gereinigt und deren Aktivitat bestatigt. Die Thermostabilitat einer Single-chain PGA erhohte sich im Vergleich zur FJAT-PGA um weitere 3,7 °C, wahrend die Schmelzpunkte der Hybrid-PGAs zwischen denen der ursprunglichen Varianten lagen, ohne erkennbaren Einfluss der einzelnen Untereinheiten. Weiterhin wurden die Bm-, Bt- und FJAT-PGA als quervernetzte Enzymkristalle (CLECs) immobilisiert, um die Prozessstabilitat zu erhohen und eine Wiederverwendbarkeit zu ermoglichen. Die Untersuchung der mechanischen Stabilitat der CLECs zeigte, dass die FJAT-PGA-CLECs unter den untersuchten PGA-CLECs am stabilsten und gleichzeitig noch aktiv waren. Um grosere Mengen an CLECs herstellen zu konnen, wurde auserdem die Kristallisierbarkeit der FJAT-PGA durch Reduktion der Oberflachenentropie verbessert. Dabei wurden neun flexible Aminosaurereste auf der Enzym-Oberflache durch Alanin ersetzt. Bei diesen Varianten entstanden bereits nach wenigen Minuten Kristalle. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte auserdem die Sekretion einer weiteren PGA aus B. massiliogorillae durch Screening einer plasmidbasierten Signalpeptid-Bibliothek verbessert und so erstmalig eine Reinigung und Charakterisierung dieser PGA ermoglicht werden. Zusammengefasst bilden die in dieser Arbeit identifizierten, hochaktiven und thermostabilen PGAs zusammen mit den eingesetzten Protein-Engineering-Experimenten und der Immobilisierung die Grundlage fur die Etablierung neuer PGA-basierter biotechnologischer Prozesse.