Identifikation, Klonierung und retroviraler Transfer allorestringierter FMNL1-peptidspezifischer T-Zellrezeptoren für die Entwicklung adoptiver Immuntherapien gegen B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphome

Die adoptive T-Zelltherapie ist eine attraktive Alternative zu konventionellen Therapien zur Behandlung von malignen Erkrankungen. So konnten bereits Tumorremissionen bei Melanompatienten nach adoptivem T-Zelltransfer erreicht werden (Dudley et al, 2002b; Morgan et al, 2006). Wahrend im autologen System jedoch oft nur unzureichende Antitumorantworten zu generieren sind, zeigt der Erfolg der allogenen Stammzelltransplantation, dass im allogenen System T-Zellen hoch effektiv Tumorzellen bekampfen konnen. Die allogene Stammzelltransplantation konnte auch bei B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen, wie beispielsweise der chronischen lymphatischen Leukamie (CLL), mit Hilfe eines Transplantat-gegen-Leukamie-Effektes (Graft-versus-Leukemia, GvL) lang andauerndes, krankheitsfreies Uberleben bewirken. Sie birgt aber ein sehr hohes Morbiditats- und Mortalitatsrisiko auf Grund der Transplantat-gegen-Wirts-Erkrankung (Graft-versus-Host-Disease, GvHD) in sich. Die im Transplantat enthaltenen T Zellen sind hierbei sowohl fur den erwunschten GvL-Effekt verantwortlich, gleichzeitig aber auch fur die unerwunschte GvHD (Horowitz et al, 1990; Kolb et al, 2004). Zur Minimierung des Risikos einer GvHD konnten T Zellen eingesetzt werden, die spezifisch und allorestringiert Peptide von tumorspezifischen Antigenen erkennen und somit bevorzugt Tumorzellen angreifen. Die Reaktivitat der T Zellen kann durch einen T Zellrezeptor (TZR)-Transfer auf sekundare Zellen ubertragen werden. Diese transgenen Zellen konnen dann mittels adoptivem T Zelltransfer im Patienten zur selektiven Bekampfung von Tumorzellen zum Einsatz kommen. In Vorarbeiten wurde FMNL1 (formin related protein in leukocytes 1) als hoch attraktives tumorassoziiertes Antigen identifiziert, das in der chronischen lymphatischen Leukamie (CLL) und in anderen Lymphomen, sowie in Zelllinien solider Tumoren stark uberexprimiert wird, wahrend es in gesunden Zellen fast ausschlieslich in hamatopoetischen Zellen vorkommt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, allorestringierte FMNL1-peptidspezifische T-Zellen zu isolieren, zu charakterisieren und den T-Zellrezeptor dieser T-Zellen in sekundare Zellen zu transduzieren. Hierzu wurden Peptide des tumorassoziierten Antigens FMNL1 mit Hilfe von Pradiktionsalgorithmen vorhergesagt und in T Zell-Stimulationsansatzen eingesetzt. Unter Einsatz von HLA-A2-positiven T2-Zellen als antigenprasentierende Zellen, die mit dem pradizierten synthetischen Peptid FMNL1-PP2 beladen waren, ist es gelungen allorestringierte, FMNL1-PP2-spezifische T Zellen eines gesunden HLA-A2-negativen Spenders zu isolieren. Von 67 T-Zellklonen bzw. oligoklonalen T-Zellen konnte bei neun T-Zellklonen Allorestriktion und FMNL1-PP2-Peptidspezifitat nachgewiesen werden. Der T-Zellklon SK22 war fur diese neun T-Zellklone, die auf Sequenzebene einen identischen T-Zellrezeptor aufwiesen, reprasentativ. Der T-Zellklon SK22 zeigte in Reaktion auf peptidbeladene T2-Zellen eine hohe Peptidspezifitat fur FMNL1-PP2 im Kontext mit dem fur SK22 allogenen HLA-A2. Nach Zielzellerkennung sezernierte der T-Zellklon Zytokine wie IFNγ, TNFα, GM-CSF und teilweise IL2. Der T Zellklon zeigte eine hohe Aktivitat und mittlere Aviditat gegen FMNL1 PP2-beladene T2-Zellen. Des Weiteren wurde die Reaktivitat gegen unbeladene native Zellen getestet. Der T-Zellklon SK22 erkannte verschiedene Zellen, wenn sie HLA-A2-positiv waren und gleichzeitig FMNL1 exprimierten. Hierzu zahlten zum einen maligne Zellen, darunter verschiedene Epstein-Barr-Virus (EBV)-positive und EBV-negative Lymphomzelllinien und die Nierenzellkarzinomzelllinie RCC26, die gut erkannt wurden sowie CD40-aktivierte CLL-Zellen, die schwacher erkannt wurden. Bei der Untersuchung von gesundem Gewebe wurden FMNL1-exprimierende HLA-A2-positive periphere Blutleukozyten (PBL) schwach und B-Zellen in mittlerer Starke erkannt. HLA-A2-positive Zellen, die FMNL1 nicht exprimieren, wie beispielsweise Lungenfibroblasten, wurden vom T-Zellklon SK22 nicht erkannt. Der T Zellklon zeigte Kreuzreaktivitat gegen neun verschiedene lymphoblastoide Zelllinien (LCL), die Allelvarianten von HLA-A2 exprimierten. Zusatzlich wurden 4 von 18 HLA-A2-negativen LCL-Zelllinien erkannt. Jeweils zwei dieser vom T Zellklon SK22 erkannten HLA-A2-negativen LCL-Zelllinien trugen ein gemeinsames MHC-Klasse-I-Molekul. Eines davon war HLA-A*3303, welches durch die Erkennung der HLA-A*3303-positiven Transfektante der C1R-Zelllinie bestatigt werden konnte. Das andere war HLA-A*6802, welches zur HLA-A2-Superfamilie gehort. Der T-Zellrezeptor des T-Zellklons SK22 wurde identifiziert, sequenziert und kloniert, sowie mit Hilfe von Retroviren in sekundare Zellen eingebracht. Durch den Transfer des T Zellrezeptors von SK22 in sekundare Zellen konnte nachgewiesen werden, dass dieser T Zellrezeptor fur die spezifische Reaktivitat des T-Zellklons SK22 verantwortlich war. Dies zeigte sich in der T-Zellrezeptor-Oberflachenexpression nach Transduktion in Jurkat76-CD8α-Zellen und in der Ubertragung der Funktionalitat des T-Zellklons in PBL. Der T Zellrezeptor von SK22 ist ein „schwacher“ Rezeptor, da er in der Konkurrenzsituation mit einem weiteren Rezeptor nur in geringem Grade an der Zelloberflache von PBL exprimiert wurde. Durch einen Austausch der jeweiligen konstanten Regionen der T-Zellrezeptor-SK22-Sequenzen durch die konstanten Bereiche eines murinen T-Zellrezeptors konnten in der Summe verbesserte Expressionswerte in Jurkat76-Zellen und eine verbesserte Funktionalitat in PBL erreicht werden. Der T-Zellklon SK22 zeigte Allorestriktion, FMNL1-PP2-Peptidspezifitat und Zytotoxizitat gegen FMNL1-exprimierende Zellen, insbesondere gegen Tumorzellen. Die beobachtete Kreuzreaktivitat ist Fokus weiterfuhrender Untersuchungen. Im Fall des T-Zellrezeptors von SK22 bedeutet es, dass Spender und Patienten sorgfaltig nach Analyse des gesamten MHC-Klasse-I-Expressionsmuster ausgewahlt werden mussen. Im Rahmen einer haploidentischen Stammzelltransplantation ist jedoch der klinische Einsatz dieses spezifischen T-Zellrezeptors zur Behandlung von B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen und anderen FMNL1-uberexprimierenden Tumorerkrankungen vielversprechend.