Clonage et expression d'un nouveau cytochrome P450 végétal catalysant l'oxydation des acides gras

Le but de ce travail etait d’isoler et de sequencer des P450s microsomiques de vesce impliques dans l’omega-oxydation des acides gras. Nous avons developpe une nouvelle methode de marquage chimique des P450s par des inhibiteurs selectifs bases sur le mecanisme catalytique qui inactivent les activites de ces P450s. La possibilite de suivre la radioactivite des enzymes alkylees, au lieu de leur activite reconstituee, est un avantage pour isoler ces P450s. Nous avons reconstitue les activites omega-hydroxylases des acides laurique et oleique avec une preparation partiellement purifiee en P450 a partir des microsomes de plantules de vesce traitees par le clofibrate. Une incubation avec cette preparation et du [1-14C]11-DDYA montre un marquage d’un moins deux proteines (PM environ 53 kDa). Une de ces proteines marquees, detectee par auroradiographie, a ete isolee par une suite d’electrophoreses et hydrolysee directement dans un gel par la protease V8. Apres transfert des peptides sur une membrane d’Immobilon, une sequence interne de cette hemoproteine a ete obtenue. En utilisant des oligonucleotides degeneres correspondant a la sequence peptidique specifique, nous avons amplifie par RT-PCR sur des ARNs de plantules de vesce induites par le clofibrate un fragment specifique. Par criblage d’une banque d’ADNc correspondant, nous avons isoles un clone complet (VAGH111) qui comporte le domaine conserve chez tous les cytochromes P450s correspondant a la zone de fixation de l’heme. Le comite de nomenclature (Nebert et al. ) (moins de 40% d’identite en acides amines avec tous les cytochromes P450) a classe VAGH111 dans une nouvelle famille et l’a nomme CYP94A1. Le clone CYP94A1 a ete exprime dans une souche de levure surexprimant sa propre NADPH-cytochrome P450 reducatase. Des etudes de specificite de substrats montrent que les vitesses de metabolisation des acides laurique et myristique sont 5 fois superieures a celles des acides palmitique, oleiques et linoleique.