Analysis of RNA silencing systemic signal in agroinfected leaves of cocoa (Theobroma cacao L.)

Parmi les nombreuses approches basees sur la perte ou le gain de fonction, utilisees pour valider la fonction des genes, de nouvelles techniques utilisant les mecanismes de l'ARN interference ont ete developpees ces dernieres annees. Elles reposent sur l'induction de l'extinction de genes induite par la production d'ARNs double-brins dans les cellules. L'ARN interference repose sur un ensemble de mecanismes conserves chez les eucaryotes pour lesquels un ARN double brin va cibler la degradation d'ARN homologues via la production de petits ARNs interferents ( siRNAs). Dans certains cas, il a pu etre montre que l'extinction d'un gene induite localement par interference de l'ARN pouvait diffuser dans l'organisme pour devenir systemique. Ces mecanismes d'extinction peuvent etre induit par agroinfiltration. Cette technique permet l'expression transitoire d'ADN-T portant une cassette RNAi dans des cellules foliaires via Agrobacterium tumefaciens. La cassette RNAi est transcrite en ARN presentant une structure en epingle a cheveux qui apres degradation dans le cytosol va donner des siRNAs. Ces petits ARNs vont cibler la degradation de tous les ARNs cellulaires qui leurs sont homologues en terme de sequence. Cette technique d'expression transitoire via Agrobacterium puisqu'elle permet d'obtenir, de maniere reversible et rapide, une forte expression de gene dans une zone distincte et definie de la feuille, est utilisee pour induire l'interference de l'ARN et etudier d'eventuels mouvements de siRNA entre cellules ou systemique. L'objectif de cette etude consiste a developper une technique d'agroinfiltration de feuille de cacaoyer permettant de declencher la production de siRNA dans quelques cellules puis de produire des lignees KO apres diffusion d'un signal systemique generalisant la degradation ciblee des ARNs cibles a tout l'organisme. Une telle technique pourrait constituer un outil de choix pour la decouverte et la validation a grande echelle de la fonction de genes d'interet. Plusieurs vecteurs utilisant la technologie de recombinaison Gateway ont ete developpes pour declencher la degradation ciblee des ARNm de differents genes du cacaoyer. En se basant sur la methode d'agroinfiltration utilisee pour la transformation in planta de Nicotiana benthamiana, nous avons developpe une technique efficace et reproductible d'agroinfiltration de feuille de cacaoyer. En utilisant des sequences specifiques du gene codant pour la phytoene desaturase (pds) ou pour un transporteur d'efflux d'auxine (gene pin1), nous avons demontre que le mecanisme d'interference de l'ARN pouvait etre induit in planta dans les feuilles de cacaoyer. Pour les deux genes etudies, il a ete possible de detecter par northern blot des siRNA specifiques de la degradation de leur ARNm et de montrer l'accumulation de ces siRNAs dans les tissus agro-infectes au cours du temps. De plus, deux types de siRNA de 21 et 25 nucleotides ont pu etre observes lors de l'extinction du gene pin1, chacun ayant semble-t-il un role distinct dans la diffusion du signal systemique, qui reste encore a demontrer. Cette technique d'induction in planta de l'ARN interference par transformation genetique transitoire pourrait fournir une methode rapide et efficace pour la validation fonctionnelle de genes d'interet et la creation de mutants sans avoir recours a la transformation genetique stable. (Resume d'auteur)