Contribution à la compréhension des mécanismes moléculaires de résistance de mycobacterium tuberculosis aux agents anti-tuberculeux

Malgre la disponibilite d’un traitement curatif et un vaccin largement utilise, l’OMS estime qu’approximativement un tiers de la population mondiale est infectee par Mycobacterium tuberculosis, l’agent etiologique de la tuberculose, et qu’environ 2 millions de personnes en meurent chaque annee. La comprehension de l’epidemiologie de la tuberculose et les actions de controle de la maladie ont ete, recemment, compliquees par l’emergence de bacilles tuberculeux resistants aux antibiotiques et par la synergie fournie par la co-infection avec le VIH. Une tendance alarmante pour la sante publique est l’emergence de souches resistantes a plusieurs antibiotiques (multi-resistantes, MDR), definies comme des isolats resistants au moins a l’isoniazide (INH) et la rifampicine (RIF), les deux agents anti-tuberculeux les plus puissants.La selection de mutants resistants se produit chez le patient lorsque les taux d’antibiotiques presents dans le corps sont sub-therapeutiques ou lorsque la therapie est inappropriee. Un des facteurs favorisant est l’exceptionnelle duree de la chemotherapie. Le besoin de maintenir des taux eleves d’antibiotiques pendant des mois, combine avec la toxicite inherente des agents, resultent en une observance incomplete du traitement par le patient et le risque d’acquerir des resistances. La resistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis resulte d’alterations dans des genes chromosomiques specifiques. Les causes genetiques de la resistance ont ete definies pour certains antibiotiques bien que plusieurs inconnues persistent. Le present travail a consiste en l’etude du probleme de la resistance aux antibiotiques anti-tuberculeux par differentes approches : l’analyse genetique des mecanismes de resistance, l’evaluation de l’activite therapeutique de nouvelles molecules et la caracterisation du profil de resistance de souches cliniques. L’acide p-aminosalicylique (PAS) est un antibiotique bacteriostatique de deuxieme ligne dont le mecanisme d'action sur le bacille tuberculeux est incompris. Recemment, en utilisant la mutagenese par transposon, la resistance au PAS fut associee a des mutations de la thymidylate synthase encodee par le gene thyA. Suite a cette decouverte, nous avons entrepris une etude moleculaire de souches cliniques et de mutants spontanes resistants au PAS. Des mutations du gene thyA furent identifiees chez seulement 37% des souches. En tout, vingt-quatre mutations differentes furent identifiees dans le gene thyA. Les sequences nucleotidiques de cinq autres genes de la voie de synthese du folate et de la thymine (dfrA, folC, folP1, folP2, et thyX) ainsi que de 3 genes encodant des N-acetyltransferases (nhoA, aac1 et aac2) furent egalement analysees mais aucune mutation associee a la resistance au PAS n’a pu etre mise en evidence. L’utilisation de techniques bioinformatiques de prediction structurelle revele que les mutations identifiees affectent soit la structure soit le site fonctionnel de ThyA. L’etude des profils de croissance des organismes resistants au PAS nous permit de constater que les organismes porteurs d’une mutation de la proteine ThyA presentent un profil de croissance constant en presence de concentrations croissantes de PAS. Les organismes resistants au PAS possedant une proteine ThyA sauvage repondent, quant a eux, aux concentrations croissantes de PAS de facon dose-dependante, indiquant que le(s) mecanisme(s) alternatif(s) de resistance au PAS est (sont) dose-dependant(s).La thymidylate synthase est egalement une des cibles du 5-fluorouracil (5-FU), l’agent chimiotherapeutique le plus largement utilise pour le traitement du cancer colorectal avance. Etant donne l’augmentation du nombre de souches resistantes de M. tuberculosis, de nouveaux composes anti-tuberculeux sont necessaires de facon urgente. Ici, nous avons evalue l’efficacite in vitro et in vivo du 5-FU sur M. tuberculosis. La concentration minimale inhibitrice du 5-FU fut determinee sur une collection de souches cliniques sensibles et multi-resistantes ainsi que sur des mutants spontanes resistants au PAS. Tous les isolats montrerent une sensibilite au 5-FU a des concentrations allant de 0.4 a 1.8 µg/ml, et ce independamment de leur profil de sensibilite/resistance aux agents anti-tuberculeux actuels. Les etudes in vivo du 5-FU (sur un modele murin de tuberculose active) montrerent une efficacite de celui-ci durant les deux premieres semaines de traitement puis une perte d’activite a la troisieme semaine, vraisemblablement engendree par les effets secondaires du 5-FU.L’ethionamide (ETH) est un autre antibiotique de deuxieme ligne dont l’utilisation est limitee aux tuberculoses multi-resistantes etant donne les effets secondaires qu’il engendre. Ces dernieres annees, les etudes ont montre que l’ETH est un pro-medicament, transforme en forme active par l’enzyme monooxygenase EthA dont l’expression est controlee par le represseur transcriptionnel EthR. Notre etude decrit l’elaboration d’inhibiteur d’EthR capable d’augmenter la sensibilite de M. tuberculosis a l’ETH suite a l’amelioration de son activation. Les composes synthetises et selectionnes pour leur capacite a inhiber l’interaction EthR-ADN furent co-cristallises avec EthR. Les structures tridimensionnelles des complexes furent utilisees pour la synthese d’analogues capables d’ameliorer la puissance de l’ETH en culture. Les molecules les plus prometteuses furent testees sur un modele murin de tuberculose. Pour un des inhibiteurs d’EthR testes, nous avons montre que sa co-administration avec l’ETH permet une reduction de la dose d’ETH utilisee de 3 fois, pour l’obtention d’une meme reduction de charge mycobacterienne pulmonaire. Ce travail demontre la possibilite d’augmenter l’index therapeutique de l’ethionamide en agissant pharmacologiquement sur le mecanisme regulateur de son activation.Dans certaines regions du monde, le probleme de la multi-resistance devient tres present. Nous avons etudie l’etat de la situation a Mourmansk (Federation russe), une region a haute incidence de tuberculose. La resistance aux antibiotiques et l’epidemiologie moleculaire de la tuberculose furent etudiees sur des isolats collectes en 2003 et 2004 dans cette region. Une extremement haute prevalence de tuberculose multi-resistante (MDR-TB) fut constatee a la fois pour les nouveaux cas (primaires) (26%) et les cas precedemment traites (72.9%). Le typage des souches MDR primaires revele une appartenance au genotype Beijing pour la plupart des isolats (79.8%) et l’homogeneite genetique des souches suggere une transmission active au sein de la population. L’analyse moleculaire des genes impliques dans la resistance a l’INH et a la RIF montre la presence des mutations katG codon 315 et rpoB codon 531 chez, respectivement, 98,2% et 76,3% des isolats MDR-TB primaires. La haute frequence de ces mutations « communes » suggere la possible utilisation de tests moleculaires ciblant specifiquement ces mutations pour detecter rapidement la plupart des cas de MDR-TB.Nos travaux illustrent les differentes voies a suivre pour maitriser le probleme de la resistance aux antibiotiques : l’elucidation des mecanismes de resistance, le developpement de nouveaux medicaments et la detection rapide des cas de resistance.