Development of a further transgenic sugarcane cultivar resistant to glyphosate herbicide

El previo desarrollo de un evento transgenico de cana de azucar resistente al glifosato aceptada para su liberacion comercial fue llevado a cabo a partir de la transformacion genetica de la variedad RA 87-3. Durante el tiempo transcurrido para desarrollar esta tecnologia, nuevas variedades comerciales liberadas por el programa de mejoramiento local estan siendo adoptadas por los agricultores. La complejidad genomica de las variedades modernas de cana de azucar, caracterizadas por ser hibridos interespecificos, con un alto grado de poliploidia y frecuente aneuploidia, hace practicamente imposible la introgresion del transgen por retrocruzamientos en otras variedades. La transformacion directa de nuevas variedades comerciales o clones promisorios que se encuentren en etapas finales de un esquema de mejoramiento, podrian mejorar enormemente el desarrollo y la adopcion de la cana de azucar transgenica tanto por los agricultores como por los industriales. El objetivo de este estudio fue obtener eventos transgenicos resistentes al glifosato de las variedades TUC 95-10 y TUC 03-12 a partir del bombardeo de microproyectiles recubiertos por plasmidos que contengan los genes epsps y nptII. Se realizaron experimentos independientes con un total de 23 y 8 bombardeos de las variedades TUC 95-10 y TUC 03-12, respectivamente. La transformacion e integracion estable de los genes epsps y nptII se determinaron mediante el uso de la tecnica de PCR con cebadores especificos. Los eventos transgenicos fueron evaluados en condiciones ex vitro para determinar la tolerancia al glifosato, mientras que tambien se analizo su similitud genetica con la variedad que les dio origen mediante marcadores moleculares TRAP. Aunque se obtuvieron plantulas de ambas variedades, la variedad TUC 95-10 mostro una menor respuesta al cultivo de tejido, ya que solo se obtuvieron dos eventos, mientras que para la variedad TUC 03-12 se regeneraron un total de 22 plantulas. Un evento regenerado a partir de TUC 95-10 y tres eventos derivados de TUC 03-12 fueron PCR positivos para ambos genes,observandose diferentes niveles de tolerancia al herbicida. El analisis genetico de 213 loci TRAP en las 3 lineas transgenicas derivadas de TUC 03-12 indican que dos eventos comparten un 99,30% de similitud con el control no transformado, mientras que el evento restante presenta un 98,7%. Estos resultados son alentadores, ya que basados en conocimientos previos, los marcadores moleculares indicarian que los eventos obtenidos son practicamente identicos a su variedad donante, con lo cual serian adecuados para conducir ensayos comparativos adicionales a campo. ABSTRACT A previous development of transgenic glyphosate-resistant sugarcane suitable for commercial release was carried out through genetic transformation of cultivar RA 87-3.  During the time elapsed to develop this technology, new commercial cultivars produced by the local breeding program have been adopted by farmers. The complex genetics of modern sugarcane cultivars, which are interspecific hybrids, highly polyploid and frequently aneuploid, make the introgression by backcrossing of the transgene into other varieties extremely difficult. Direct transformation of new commercial cultivars or promising clones at final stages of a breeding scheme could greatly improve the development and adoption of transgenic sugarcane by both farmers and millers. The aim of this study was to obtain glyphosate-resistant transgenic events of the two recently released cultivars, TUC 95-10 and TUC 03-12, through the introduction via microprojectile bombardment of plasmids harbouring the epsps and nptII genes. A total of 23 and 8 independent bombardments experiments were carried out on TUC 95-10 and TUC 03-12, respectively. The stable transformation and integration of both epsps and nptII genes were determined by using PCR with specific primers. Transgenic events were evaluated for glyphosate tolerance under ex vitro conditions and for genetic similarity with donor plant by using target region amplification polymorphism (TRAP) molecular markers. Although plantlets of both varieties regenerated from calli, TUC 95-10 showed a low tissue culture-response since only two events were obtained, whilst a total of 22 plantlets regenerated for TUC 03-12. One line of TUC 95-10 and three lines of TUC 03-12 were PCR-positive for both genes and different levels of herbicide-tolerance were observed. Genetic analyses of 213 TRAP loci from transgenic lines derived from TUC 03-12 indicate that two events show 99.30% of similarity with the non-transformed TUC 03-12 control and the third had 98.7% similarity. These are encouraging results as, based on our previous experience, the molecular-marker data suggest that the events are practically identical to their parental cultivar, and are suitable for future comparative field testing.