Identificação da expressão das variantes 1 e 2 do gene que codifica a fosfatase alcalina em células tronco derivadas de tecido adiposo induzidas com dexametasona

Celulas tronco sao celulas indiferenciadas e multipotentes, capazes de se diferenciar nos mais diversos tipos celulares. Sao definidas por duas caracteristicas principais, a autorrenovacao e o potencial de diferenciacao. Devido ao seu potencial de diferenciacao, facilidade de isolamento e expansao em cultura, as celulas tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cell – MSCs) sao largamente utilizadas em testes para o tratamento de inumeras doencas, como doencas cardiacas, mieloma e osteoartrite. O corticosteroide dexametasona e amplamente utilizado como indutor de diferenciacao ossea em celulas tronco e esta envolvido no aumento da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Ha quatro genes que codificam a ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 e ALPI. A ALPL e um dos principais marcadores de diferenciacao ossea promovida pelo tratamento com dexametasona, esse gene possui tres diferentes variantes que sao geradas por splicing alternativo. Porem, ate hoje nao se tem conhecimento de qual dessas variantes atua na deposicao de matriz ossea. O objetivo do trabalho foi analisar, por PCR quantitativo (qPCR), a atividade das variantes de ALPL durante a diferenciacao de MSCs tratadas com dexametasona. Os primers das tres variantes do gene ALPL foram desenhados pelo nosso grupo de pesquisa. Para o experimento, aproximadamente 3x104 celulas por mL foram semeadas em placa de cultura. Para o tratamento utilizou-se dexametasona 10-7M, tendo como periodo de tratamento 0, 3 e 7 dias. Os resultados da qPCR mostraram que os primers desenhados possuem uma eficiencia superior a 90% e R2 = 1, sendo os primers da variante 2 mais eficiente que os primers da variante 1, e os primers de ambas as variantes mais eficientes que os primers de ALP atualmente utilizados. Os primers da ALPL/v3 nao apresentaram amplificacao. Nossa analise estatistica indica que a diferenca de expressao entre as celulas tratadas e os controles se mostrou relevante, apontando para um grande aumento de ALPL/v1 nas celulas tratadas. A expressao de ALPL/v2, apesar de significativa entre os controles e tratados, e baixa quando comparada a ALPL/v1. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a dexametasona, alem de aumentar a atividade do promotor de ALPL, tambem da preferencia ao splicing alternativo que origina o mRNA da variante 1 do gene.