O ÍON FERRO ESTABILIZA A LACTOFERRINA BOVINA E INTERFERE NA INTERAÇÃO CELULAR

Objetivo: Comparar a estabilidade estrutural da apo e holo-bLf e as suas consequencias em aspectos funcionais. Analisar as mudancas estruturais induzidas por ureia, guanidina e alta pressao hidrostatica na estrutura terciaria da apo e holo-bLf monitoradas por espectroscopia de fluorescencia, utilizando os triptofanos presentes em sua estrutura e bis-ANS; Comparar a estrutura secundaria da apo e holo-bLf atraves de dicroismo circular; Medir a liberacao e ligacao do ion ferro em presenca de ureia; Verificar o ∆H da apo-bLf nativa e pressurizada por calorimetria de varredura diferencial (Differential Scanning Calorimetry - DSC); Comparar a interacao da apo e holo-bLf com celulas Vero por microscopia de fluorescencia confocal. Metodologia: A apo-bLf sera obtida a partir de capsulas comercializadas pela empresa Life Extension (EUA). A proteina sera solubilizada e a celulose presente na capsula separada por sucessivas centrifugacoes. Em seguida a amostra sera filtrada, dosada, aliquotada e congelada a -20°C. A holo-bLf sera preparada com base em um protocolo desenvolvido por Bokkhin (2013) e colaboradores. O fenomeno de emissao de fluorescencia do triptofano e amplamente utilizada como uma ferramenta para monitorar mudancas conformacionais em proteinas e oligomeros frente a perturbacoes induzidas por agentes quimicos e/ou fisicos e ate mesmo ligantes. Isto ocorre, pois, este aminoacido e sensivel a mudancas de polaridade em seu microambiente. Os espectros serao obtidos com a bLf na concentracao final de 200μg/ml diluida em tampao Tris 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. Os espectros de CD serao obtidos em um espectropolarimetro Jasco modelo J-715 1505 (JascoCorp.,Tokyo, JP). Sera utilizada uma cubeta de quartzo de 0.1 cm de caminho otico e analisados na regiao de 190 a 260nm. Os espectros serao obtidos com a bLf na concentracao final de 500 μg/ml diluida em tampao Tris 25 mM, NaCl 150 mM e pH 7,5. Para verificar se o ferro estaria sendo liberado da estrutura da holo-bLf em presenca de ureia, utilizamos o espectrofotometro e realizamos as leituras a 465 nm para detectar o ferro ligado a estrutura da lactoferrina. Portanto, as amostras analisadas foram: apenas ferro livre em tampao Tris 25mM, NaCl 150mM pH 7,5, apo e holo-bLf nativas, em presenca de ureia e adicionando 50 μM de FENTA. Os termogramas de calorimetria foram feitos em um calorimetro do modelo VP-DSC da MicroCal (Northampton, MA). O calorimetro foi utilizado para medir a diferenca de capacidade calorifica entre a temperatura da cela que contem a amostra, a apo-bLf, e da cela que contem apenas a referencia, onde se encontra o tampao Tris 25 mM NaCl 150 mM e pH 7.5. Dessa forma, podemos determinar parâmetros importantes de uma proteina, tal como estabilidade. Os escaneamentos no DSC foram feitos com temperatura de 25–75 °C com uma taxa de aquecimento de 90 °C/h. A microscopia confocal por escaneamento com laser e analise de fluorescencia (LSCFM – Laser Scanning Confocal Fluorescence Microscopy) foi utilizada para verificar a cinetica de internalizacao de apo e holo-bLf em celulas Vero. Foi feita a marcacao da lactoferrina com FITC (isotiocianato de fluoresceina) na razao molar de 1:10. Apos essa preparacao, celulas Vero (celulas renais de macaco verde africano) subconfluentes foram cultivadas em placas de 35 milimetros de fundo de vidro (MatTek, Ashland, MA, USA) e incubadas com uma solucao de 1 mg/mL contendo o conjugado bLf- FITC durante 15 minutos a 4°C. Depois deste passo de sincronizacao, as moleculas de lactoferrina nao ligadas foram retiradas por sucessivas lavagens com PBS e o conjugado sera incubado com as celulas em meio DMEM a 37°C para permitir a endocitose. A 0, 30 e 60 minutos pos-aquecimento, as celulas serao lavadas novamente com PBS e fixadas com formaldeido a 3,7% durante 15 minutos e em seguida levadas ao microscopio.