Um método simplificado para análise de cotinina em urina usando CG-EM

Cotinine is the major metabolite of nicotine and, being very stable and having a long biological half-life, it can be used as a biomarker for tobacco exposure. The aim of this study was to develop an analytical GC-MS technique to measure levels of cotinine in the urine of active and passive smokers and to compare the results with reference values. The extraction of cotinine to generate the calibration curve was performed by mixing urine (250 ?L) with 50 ?L of a cotinine standard, 50 ?L of an internal standard of deuterated cotinine (15μgμmL-1) and 50 μL of 10% NH4OH solution. Next, 2 mL of a mixture of MTBE:dichloromethane:ethyl acetate (30:30:40 by volume) was added and the whole was vortexed, then centrifuged at 3000 rpm. Finally, 1.6 mL of the organic layer was evaporated under a stream of dry air at 50 °C. The resulting extract was dissolved in methanol and injected into the GC-MS system. The LOQ and LOD for cotinine were 100 and 20 ng.mL-1, respectively. The curve was linear over the whole tested range of 100 - 5000 ng.mL-1 and the method achieved 50% recovery. The intra and inter-day precisions were 1.62 ? 7.28% and 0.86 - 2.68%, respectively. Accuracy was determined at three concentrations (low, medium and high), with six replicates (95.24- 97.67%). The validation of this cotinine assay by GC-MS showed that it exhibited satisfactory limits and the assay could be performed with a one-step liquid-liquid extraction. The technique presented here can thus be used for the quantitation of cotinine levels in the urine of passive and active smokers.(AU) A cotinina e o metabolito principal da nicotina, e muito estavel e tem uma elevada meia-vida biologica e pode ser usado como biomarcador da exposicao ao tabaco. O objetivo deste estudo foi desenvolver uma tecnica analitica em CG-EM para medir os niveis de cotinina na urina de fumantes ativos e passivos e comparar os resultados com valores de referencia. A extracao da cotinina para construir a curva de calibracao foi desenvolvida misturando 250 μL de padrao de cotinina em urina, 50 μL de padrao interno (cotinina deuterada 15 ?g?mL-1) e 50 μL de solucao aquosa de NH4OH 10%. Em seguida, 2 mL da mistura MTBE:diclorometano:acetato de etila (30:30:40 v/v) foi adicionada, agitada em vortex e centrifugada a 3000 rpm. Finalmente, 1,6 mL da camada orgânica foi evaporada sob ar seco a 50 °C. O extrato resultante foi dissolvido em metanol e injetado no sistema CG-EM. Os limites de quantificacao e de deteccao foram 100 e 20 ng?mL-1, respectivamente. A curva de calibracao foi linear no intervalo de concentracao testado (100 - 5000 ng?mL-1), com 50% de recuperacao. Os valores de precisao intra-dia e inter-dia foram 1,62 ? 7,28% e 0,86 - 2,68%, respectivamente. A exatidao (95,24 - 97,67%) foi determinada sob 3 concentracoes (baixa, media e alta), com 6 replicatas. A validacao deste procedimento para analise de cotinina por CG-EM demonstrou valores satisfatorios, numa unica etapa de extracao liquido-liquido, podendo ser utilizada para a quantificacao dos niveis de cotinina em amostras de urina de fumantes ativos e passivos.(AU)