基于黄瓜花叶病毒(CMV)基因沉默载体的构建

病毒介导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）广泛应用于植物基因功能分析。本研究以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）不同株系的RNA2与CMV-Fny基因组R1和R3进行组合接种,获得在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中症状轻的病毒组合F1Tsh R2F3;将CMV-Fny基因组R1、R2、R3和Tsh2克隆到植物瞬时表达载体pCB301中,构建载体pCB301-R1R2R3。农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）浸润接种本氏烟结果显示,pCB301-R1R2R3引起寄主症状与病毒c DNA体外转录产物侵染所产生症状一致;Tsh R2的2b基因缺失3＇端的95 nt碱基（Tsh2VIGS）后病毒能系统性侵染寄主植物,但降低病毒外壳蛋白（coat protein,CP）含量;F1Tsh R2VIGS-Su351F3接种10 d后整个植株的大部分叶片出现黄色表型;qRT-PCR结果表明,pCB301-F1Tsh R2VIGS-Su351F3接种植株中的镁离子螯合镁亚基基因Sulphur m RNA含量为对照植株20%。为进一步验证该载体能否沉默植物中其他基因,将烟草中细胞自噬相关基因Beclin1基因部分序列插入载体pCB301-Tsh R2VIGS并接种于NN三生烟（N.tabacum cv.Xanthi NN）中,烟草花叶病毒（Tobacco,mosaic virus,TMV）侵染结果表明,F1Tsh R2VIGS-Beclin337F3浸润接种寄主呈现系统性坏死症状反应,而对照植株仅在TMV接种区域产生局部枯斑。本研究所获得的CMV农杆菌侵染性克隆及其VIGS载体,为构建CMV其他寄主的VIGS载体奠定基础。