031 Mise au point d’immunomarquages de protéines de régulation du cycle cellulaire sur l’endothélium cornéen monté à plat

Introduction L’immunomarquage des proteines du cycle cellulaire est incontournable pour l’etude du statut proliferatif de l’endothelium corneen. Jusqu’a present, la tres grande majorite des travaux utilisaient des coupes transversales de cornees qui donnent un acces direct aux antigenes intracellulaires mais ne permettent de visualiser qu’un nombre minime de cellules sans apporter une vue globale de l’endothelium laisse intact. But : mettre au point l’immunocytochimie sur endothelium de cornees entieres montees a plat. Materiels et Methodes Proteines etudiees : 4 proteines d’expression reconnues (ZO-1 intra-membranaire, α actine cytoplasmique, hnRNPL et histone H3 nucleaires) et 8 autres deja decrites dans l’endothelium dont 3 inhibiteurs du cycle cellulaires (P27kip1, P21, P16-INK4a) ; 3 marqueurs de proliferation (PCNA, MCM2, Ki67), 2 proteines du cycle cellulaire (cyclineD1, cyclineE). Des cornees humaines et porcines ont ete utilisees fraiches et apres organoculture a 31 °C. Fixateurs/permeabilisant testes : paraformaldehyde (PFA), acetone, methanol, ethanol, Hg ++, Zn ++, ac acetique, triton, sodium docecyl sulfate (SDS), seuls ou en combinaison. Un demasquage des epitopes par la chaleur, des agents biochimiques ou chimiques a ete teste. Resultats Des marquages tres differents etaient obtenus selon le type de fixation/permeabilisation/demasquage et selon l’etat corneen (frais vs en organoculture). Il ne semblait pas exister de protocole ubiquitaire pour tous les marqueurs. Pour hnRNP, la fixation par PFA1 % seul suffisait pour toutes les cornees. Pour H3 un post traitement par SDS etait necessaire. Pour ces 2 marqueurs, une fixation en PFA 4 % donnait des marquages tres heterogenes. L’expression de P27, P16, PCNA etait observee dans les cornees fraiches et en organoculture mais leur localisation subcellulaire differait selon le protocole utilise alors que MCM2 ne semblait pas exprime. Discussion Les elements limitants l’acces aux antigenes semblent nombreux specifiquement pour l’endothelium corneen intact. Nous insistons sur les possibilites d’erreur d’interpretation en cas de fixation/demasquage inadapte et sur la necessite d’utiliser des controles (nhRNP, H3) avant de conclure a l’absence d’expression ou a une expression regionale au sein de l’endothelium. Conclusion L’utilisation de ces protocoles specifiques devrait permettre une localisation precise des proteines du cycle sur un endothelium corneen entier intact.