核桃 JrGA2ox 基因的克隆、亚细胞定位及功能验证

目的GA2-oxidase（GA2ox）是赤霉素合成过程中起负调控作用的一种关键酶，能够催化有活性的赤霉素为无活性的赤霉素，从而对植物生长起到一定的抑制作用。本研究主要对核桃中赤霉素氧化酶基因 JrGA2ox 进行克隆及功能验证，有利于进一步探究核桃 JrGA2ox 基因在植物生长和发育过程中，尤其是在植物株高调控中的作用，从而助力于挖掘与利用核桃中更多的优质基因，培育出更多优良的核桃品种。 方法采用PCR扩增技术，克隆获得核桃 JrGA2ox 基因的全长编码序列，进一步通过In-Fusion克隆技术构建具有强启动子的 35S ∷ JrGA2ox ∷ GFP 过表达载体；利用BLAST网络在线工具得到其他植物中的JrGA2ox同源氨基酸序列，并对其进行氨基酸同源序列比对和系统进化分析；其后，通过亚细胞定位揭示其发挥功能的场所，进一步利用农杆菌介导法将构建好的过表达载体转化到核桃体细胞胚中，获得 JrGA2ox 超表达的阳性转化植株，深入分析 JrGA2ox 基因的生物学特性。 结果通过基因克隆，得到1条 JrGA2ox 开放阅读框，其全长为1 056 bp，共编码351个氨基酸，分子量为39.25 kDa。通过比对发现，该基因编码的蛋白序列含有保守2OG-FeⅡ-Oxy蛋白结构域，具有GA2-氧化酶蛋白家族共同的结构特点，表明 JrGA2ox 属于 GA2 -氧化酶基因家族。氨基酸进化树比对分析结果显示，核桃JrGA2ox与毛白杨PtGA2ox聚为一个分支。且JrGA2ox蛋白与木本植物川桑MnGA2ox1、西洋梨PcGA2ox、桃PpGA2ox1及苹果MdGA2ox1蛋白序列同源性较高。烟草叶片表皮细胞亚细胞定位分析表明，JrGA2ox是定位于细胞核与细胞膜中的蛋白。对核桃体细胞胚进行基因遗传转化后经荧光检测及PCR验证表明， 35S ∷ JrGA2ox ∷ GFP 过表达载体被成功转入核桃体细胞胚中。阳性再生植株株高与对照苗相比具显著性差异，其平均株高为对照植株的1/2；且其株高与 JrGA2ox 基因表达量呈负相关。 结论核桃JrGA2ox蛋白亚细胞定位于细胞核与细胞膜中。 JrGA2ox 基因调控核桃株高，主要起到负调节作用。阳性基因转化再生植株中 JrGA2ox 基因的表达量升高，并表现出明显的矮化特征。本研究结果可为进一步分析该基因在核桃生长发育过程中的作用提供技术参考，且为优良的矮化核桃品种选育奠定一定的基础。