Purification, characterization, crystallization, crystal structures and mechanism of aurone synthase from Coreopsis grandiflora

Aurone Synthasen (AUS) gehoren zu der Familie der Polyphenol Oxidasen (PPOs) und sind spezialisiert auf die oxidative Umwandlung von Chalconen zu Auronen (gelbe Blutenpigmente). In dieser Studie werden die Reinigung, biochemische Charakterisierung, Kristallisation, Kristallstrukturen und molekulare docking Studien mit nachfolgenden Molekulardynamischen Simulationen einer AUS von Blutenblattern von Coreopsis grandiflora prasentiert. Die notwendige quantitative Abtrennung der im Rohextrakt enthaltenen Pigmente konnte mit Hilfe einer Kombination von wassrigen Zweiphasenextraktionen, die auch zur Reinigung anderer Proteine geeignet ist, erreicht werden. Sequenzanalysen zeigten, dass AUS zu einer neuen Gruppe von PPOs gehort und dass eine Insertion in einer Loopregion uber dem aktiven Zentrums charakteristisch fur diese Gruppe ist. Auserdem wurde eine bisher einzigartige Disulfidbrucke zwischen der katalytisch aktiven mit der abschirmenden C-terminalen Domain nachgewiesen. Das aktive Enzym zeigte eine sehr hohe Affinitat / katalytische Effizienz gegenuber Chalcone, was die Annahme bestatigt, dass Chalcone die naturlichen Substrate der isolierten PPO sind. Auserdem legte die kinetische Charakterisierung nahe, dass die Bildung der Aurone in C. grandiflora auf der Stufe der Chalcone Aglycone erfolgt, was bedeuten wurde, dass es in Asteraceaen einen alternativen Aurone Biosyntheseweg gibt, als den, der bereits fur A. majus (Plantaginaceae) beschrieben wurde. Das latente pro-enzym zeigte eine allosterische Aktivierung durch in situ gebildete o-Chinone. In Kombination mit der erhaltenen Kristallstruktur der pro-AUS, welche die erste die erste Kristallstruktur einer pflanzlichen pro-PPO reprasentiert, konnten Erkenntnisse uber die Abschierumgsstrategie und die allosterische Aktivierung pflanzlicher PPOs erhalten werden. Mit Hilfe der Kristallstruktur der proteolytisch aktivierten AUS konnte eine Sulfatierung eines Cu-bindenden Histidines nachgewiesen werden, welches zur Inaktivierung durch den Verlust eines Cu-Atoms der PPOs fuhrt. Obwohl AUS eine Catechol Oxidase ist, zeigte das Enzym Hydroxylase Aktivitat gegenuber seinem naturlichen Substrat und ein neuer Reaktionsmechanismus fur pflanzliche PPOs vorgeschlagen. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Hydroxylase Aktivitat eine generelle Eigenschaft der PPOs und nicht auf Tyrosinasen begrenzt ist. Daher ist es wahrscheinlich, dass PPOs im Sekundarmetabolismus von Pflanzen an der Hydroxylierung von bisher nicht zugeordneten phenolischen Verbindungen von beteiligt sind. Auserdem wird der positive Einfluss von Hexawolframtellurat(VI) (TEW), einem Polyoxometallat, als Kristallisationsadditiv auf die Kristallisation und die Kristallqualitat der pro-AUS prasentiert. Analysen zeigten, dass TEW neue Kristallkontakte vermittelt und die freie Kristallisationsenergie erniedrigt, weshalb TEW ein neues vielversprechendes Kristallisationsadditiv in der Protein Kristallisation darstellt.