Carbohydrate multivalent systems to functionalize proteins and surfaces for lectin interaction studies

Las interacciones entre proteinas y carbohidratos estan involucradas en muchos eventos biologicos fundamentales. En estos procesos, una clase de proteinas que reconocen azucares denominadas lectinas juegan un papel crucial. Actualmente, numerosos grupos de investigacion se encuentran estudiando esta importante clase de proteinas; sin embargo, muchas de ellas estan aun por explorar y no se conoce en detalle sus especificidades frente a carbohidratos y los factores moleculares que gobiernan dicha interaccion. En la naturaleza, muchas lectinas se encuentran en forma de oligomeros para promover una elevada para glicanos especificos. Esto se debe al hecho de que la interaccion carbohidrato-proteinas es muy debil, con una especificidad y selectividad limitadas por unidad de azucar. Por lo tanto, para compensar esta interaccion paradojicamente debil, la Naturaleza juega la carta de la multivalencia mediante una presentacion multivalente del receptor, asi como de los carbohidratos. En este sentido, con el objetivo de estudiar estos procesos multivalentes de reconocimiento entre carbohidratos y proteinas, los sistemas de carbohidratos multivalentes artificiales se han revelado como herramientas muy eficientes para el estudio de dichas interacciones. En este contexto, el objetivo principal de esta Tesis Doctoral es el desarrollo y la preparacion de sistemas multivalentes de carbohidratos para comprender mejor los mecanismos que impulsan las interacciones de estas proteinas de union a carbohidratos. Para lograr este objetivo general, se propusieron los siguientes objetivos especificos: • Preparacion de superficies multivalentes basadas en glicodendrones y el estudio de la interaccion carbohidrato-proteina sobre dichas superficies, para evaluar el efecto de la presentacion del ligando en la interaccion. Para alcanzar este objetivo, hemos desarrollado microarrays recubiertos con dendrones de ciclooctino, a partir de los cuales se han generado los correspondientes glicodendrones directamente sobre el chip, a traves de una reaccion de tipo click en ausencia de Cu (SPAAC) con diferentes tipos de carbohidratos funcionalizados con un grupo azida en su extremo reductor. Las superficies hidrofobas utilizadas permiten el uso de la deteccion por medio de la espectrometria de masas MALDI-TOF, permitiendo asi verificar la finalizacion de cada reaccion (>95%). Con este nuevo metodo se realizaron varios estudios de interaccion usando lectinas marcadas fluorescentemente, fundamentalmente ConA y DC-SIGN. En particular, se observo una fuerte union para el disacarido αMan1,2Man, en todas las valencias y concentraciones empleadas. Como se esperaba, la senal fluorescente aumenta al aumentar la valencia todas las concentraciones utilizadas. En estos estudios tambien se ha puesto de manifiesto que las lectinas que reconocen manos, no muestran ninguna interaccion para los glicodendrones de β-D-galactosa. Todos estos resultados demuestran la eficacia y la versatilidad real de la tecnica desarrollada. • Preparacion de nuevas glycodendriproteinas mediante la funcionalizacion de la proteina BSA con carbohidratos y evaluacion de su interaccion con lectinas. Se ha desarrollado un metodo de preparacion rapido, simple, economico y versatil de proteinas funcionalizadas con glicodendrones. En primer lugar, se han sintetizado varias familias de glicodendrones con un grupo azido en la posicion focal. Estos grupos funcionales se han utilizado para conjugar las moleculas en la proteina BSA mediante metodologias de reaccion de tipo click catalizada por Cu(I) (CuAAC) entre los grupo azida de los glicodendrones y los grupos alquino en la proteina, previamente derivatizada con este grupo funcional. Asi, fue posible alcanzar dos grados de funcionalizacion, bajo (10-15 unidades de azucar) y alto (30-35 unidades de azucar). Las neoglicoproteinas sintetizadas han mostrado una buena actividad inhibitoria frente a lectinas lectinas humanas como Langerin y DC-SIGN. En particular, excelentes resultados fueron obtenidos con las neoglicoproteinas funcionalizadas con glicodendrones de αMan1,2Man. De hecho, estas estructuras han revelado una actividad, en terminos de inhibicion de la actividad enzimatica, en el rango bajo nanomolar. Esto demuestra que la proteina es una buena plataforma para exhibir, y de este manera, mejorar el reconocimiento de los glicanos frente a los receptor de azucares. • Diseno y desarrollo de una sintesis rapida que permita obtener el disacarido Man1,2Man en gran escala y, con ello, permitir la preparacion de estructuras de glicodendrones. Este objetivo se ha logrado mediante la adopcion de una sintesis consecutiva de 5 etapas para obtener el aceptor de glicosilo, reduciendose de manera significativa el coste total y el tiempo de preparacion de este intermedio clave. Usando esta estrategia, fue posible obtener el disacarido deseado en escala de gramos y en menos de dos dias y sobre todo con una mejoria del 30% sobre el rendimiento global, en comparacion con la estrategia sintetica tradicional paso a paso. Con este disacarido Manα1,2Man, se han preparado glicodendrones con biotina en la posicion focal. Estos glicodendrones se van a utilizar, en el futuro, para estudios de interaccion con lectinas empleando la resonancia de plasmon de superficie de imagen (SPRi).