Purificação de DNA plasmidial de Bacillus thuringiensis por ultracentrifugação em gradiente de cloreto de césio.

DNA plasmid. Bacillus thuringiensis e seus plasmideos. Purificacao de DNA plasmidial por ultracentrifugacao em gradiente de cloreto de cesio (CsCl). Estirpes utilizadas neste trabalho. Condicoes de crescimento e extracao de DNA plasmidial. Preparo do DNA plasmidial e ultracentrifugacao gradiente de CsCl. Identificacao e coleta das bandas de interesse. Analise eletroforetica. Bacillus thuringiensis e uma bacteria que sintetiza delta-endotoxinas letais para diferentes grupos de insetos, sendo a maior responsavel pelo mercado ,mundial de bioinseticidas. As proteinas toxicas sao codificadas por genes denomonados cry, presentes em plasmideos conjugativos com mais de 30 Mda, e que geralmente, sao dificeis de serem purificados pelos metodos rotineiros de extracao e purificacao. O objetivo deste trabalho foi ajustar um metodologia para obtencao dos plasmideos presentes nas estirpes de B. thuringiensis, a partir da tecnica de ultracentrifugacao em gradiente de cloreto de cesio. Neste caso, foram usados como modelo as estirpes HD-1 e S76 da subespecies kurstaki. O metodo de lise alcalina e purificacao em gradiente de cloreto de cesio empregado, permitiu a obtencao de grandes quantidades de DNA plasmidial com alto grau de pureza. Foram realizadas adaptacoes no protocolo original que tornaram o protocolo utilizado para as estirpes HD-1 e S76 uma tecnica menos laboriosa e mais rapida. Ainda houve reducao significativa na quantidade de brometo de etideo empregada e na quantidade de residuos quimicos solidos contaminados com essa substância, extremamente toxica, que foram usados no processo. O procedimento de purificacao descrito fio um metodo adaptado para purificacao dos pequenos e grandes plasmideos de B. thuringiensis e foi usado com sucesso para as estirpes HD-2 e S76. Bacillus thuringiensis is a Gram positive bacterium that synthesizes delta-endotoxinas lethal to different groups of insects therefore has been the largest responsible for the worlf market of bioinseticidas. The toxic proteins are coded by genes denominated cry, persents in conjugatives plasmids with more than 30 Mda and that generally are difficult to be purified by the routine methods of extraction and purification. The objective of this work was to adjust the ultracentrifugation methodology in gradient of cesium chloride to obtain purified plasmids in HD-1 and S76 strains of B. thuringiensis subsp. Kurstaki. The procedure allwed to obtain great amounts of plasmids DNA from HD-1 and S76 strains with high degree of purity. In addition, it was less laborious and much faster. Besides, there was significant reduction in the amounts of ethidium bromide and of solid chemical residues contaminated with the toxic substance. The described protocol is a modification of a purification method for small and big plasmids of B. huringiensis strains and could be applied with sucess for strains the HD-1 and S76.