粟酒裂殖酵母N-糖酰胺酶在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

根据GenBank中公布的粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）N-糖酰胺酶（PngIp）cDNA序列，设计并合成一对特异性引物，利用RT-PCR技术从粟酒裂殖酵母中克隆出糖酰胺酶cDNA。将得到的基因克隆到表达载体pET-15b中。重组质粒转入大肠杆菌BL2I（DE3）中，经诱导表达和纯化提取后，进行酶活测定。实验结果表明，该酶的分子量约为39kD，纯化后的重组N-糖酰胺酶可以对变性处理的糖蛋白进行糖链的切除，且这种作用需要还原剂DTF的辅助作用：N-糖酰胺酶只对错误折叠的糖蛋白有作用，对天然的糖蛋白没有作用。等量粟酒裂殖酵母Pnglp在不同温度、pH、DTF浓度和底物变性温度下对等量核糖核酸酶B（RNase B）的脱糖基化检测发现，重组酶的最适反应温度30℃，最适反应pH为7．0，需要的最适DTT浓度为10mmol／L，底物在100℃处理10min时酶的脱糖基化率最高。