Korrektur der beta c-defizienten pulmonalen Alveolarproteinose (PAP) durch hämatopoetischen Stammzell-Gentransfer in einem beta c-defizienten Mausmodell

Die βc-defiziente Pulmonale Alveolarproteinose (βc-PAP), die durch das Fehlen der gemeinsamen β-Kette (βc) der IL-3-/IL-5-/GM-CSF-Rezeptoren charakterisiert ist, stellt eine monogene Erkrankung dar, die durch eine funktionelle Insuffizienz der pulmolaren Alveolarmakrophagen bedingt ist. Hamatopoetische Stammzell-Gentherapie konnte die defekte βc-Rezeptorkette in den Alveolarmakrophagen korrigieren und eine kurative Behandlungsoption darstellen. Ziel dieser Arbeit war es, in einem murinen mβc-„knock out“-Modell den Effekt des mβc-Gentransfers in vitro und in vivo zu untersuchen. Dazu wurde im ersten Schritt ein retroviraler Vektor konstruiert, der die cDNA der murinen-βc (mβc-)-Kette in Kombination mit der cDNA einer Punktmutante des Chemotherapie-Resistenzgens O6-Methylguanin-DNA-Methyltansferase (MGMTP140K) als selektierbaren Marker exprimiert. Fur eine effiziente Transduktion hamatopoetischer Zellen war es dann notwendig, hochtitrige Viruspraparationen zu generieren. Dazu wurde eine neue stabile ekotrope Verpackungszelllinie hergestellt, die es ermoglichte, Viruspraparationen mit infektiosen Titern von bis zu 2 x 106 IE/ml zu produzieren. Mit diesen Viruspraparationen lies sich eine Gentransfereffizienz von 13 - 35% in primaren hamatopoetischen Zellen mβc-defizienter Mause erreichen. In vitro konnte durch den retroviralen Gentransfer der mβc-cDNA in hamatopoetische Vorlauferzellen von mβc-/--Mausen eine Wiederherstellung der GM-CSF-Antwort erreicht werden, wie sich durch eine Koloniebildung von korrigierten KM-Zellen in Gegenwart von GM-CSF nachweisen lies. Die GM-CSF-Sensitivitat derartig „reparierter“ mβc-/--Zellen entsprach der von KM-Zellen aus Wildtypmausen. In Wildtyp-KM-Zellen wurde zumindest in den Experimenten der vorliegenden Arbeit keine Veranderung der GM-CSF-Sensitivitat nach zusatzlicher transgener mβc-Expression beobachtet. Zudem konnte in vitro eine funktionelle MGMTP140K-Expression nach Gentransfer durch eine erhohte Resistenz transduzierter Vorlauferzellen in klonogenen Assays gegenuber einer kombinierten O6-Benzylguanin/Temozolomid (BG/TMZ) Behandlung beobachtet, sowie eine signifikante Anreicherung genetisch korrigierter mβc-/--Zellen nach BG/TMZ-Exposition gezeigt werden. In der Folge konnte in unserem murinen βc-PAP-Mausmodell auch in vivo die Wiederherstellung der GM-CSF-Sensitivitat der hamatopoetischen Vorlauferzellen nachgewiesen werden. Vor allem aber wurde zum ersten Mal gezeigt, dass durch den mβc-Gentransfer eine Ruckbildung der pulmonalen Erkrankung erreicht werden kann. Die Alveolarraume der genetisch korrigierten mβc-/--Mause wiesen eine nahezu vollstandige Reduktion des akkumulierten PAS-positiven Proteinmaterials sowie der erkrankungstypischen peribronchioalveolaren Lymphozyteninfiltrate auf. Eine zusatzliche BG/TMZ-Behandlung fuhrte zu einer effektiven In-vivo-Anreicherung transduzierter Zellen in den korrigierten mβc-/--Mausen, war jedoch in den Experimenten der vorliegenden Arbeit zur Behebung der pulmonalen Erkrankung nicht erforderlich. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die genetische wie funktionelle Korrektur des Defekts in mβc-/--Zellen in vitro wie auch in vivo moglich ist, und die MGMTP140K-Expression bei Bedarf die Anreicherung genetisch korrigierter Zellen zulasst. Damit ist ein wichtiger erster Schritt in Richtung einer potentiellen klinischen Anwendung des retroviralen βc-Gentransfers als mogliche Behandlungsmethode der βc-PAP getan.