EHEC O157：H7二重PCR的建立及应用

建立用于从临床样品中检测EHEC O157：H7的二重PCR方法。根据GenBank登录EHEC O157：H7序列,通过对菌体和鞭毛抗原保守性核苷酸序列的比对和分析,分别设计编码O抗原rfbE基因和编码H抗原fliC基因各1对特异性引物,建立二重PCR检测方法,并以EHEC O157：H7纯培养和模拟制备的3种阳性样品为原材料,对方法的敏感性和特异性进行分析。运用成功建立的二重PCR,从带菌率最高的牛粪便中检测EHEC O157：H7,并进行菌株分离和鉴定。成功建立了rfbE与fliC的二重PCR方法,rfbE与fliC引物比例为2.5∶1,PCR循环参数中退火温度为56℃,扩增片段长度rfbE为812 bp,fliC为625 bp。检测阳性临床样品检测敏感性可以达到10 cfu/g。检测24株非EHEC O157：H7大肠杆菌和15株非大肠杆菌,只有EHECO157：H7能够扩增出特异性的rfbE条带,EHEC O157：H7和EPEC O55：H7能够扩增出fliC。只有EHEC O157：H7能够同时扩增出rfbE与fliC 2条目的条带。从63份牛粪便样品中分离到4株EHEC O157：H7：生化试验表明4株EHEC O157：H7具有典型EHECO157：H7的生化特性;药敏试验表明4株EHEC O157：H7具有较为广谱的耐药性;rfbE序列分析与GenBank序列同源性介于97.3%～99.2%之间,fliC序列与GenBank序列同源性介于97.6%～100%之间;4株EHEC O157：H7对Balb/c小鼠的致病性有差异,EHEC O157：H728#和EHEC O157：H738#致病性强,EHEC O157：H73#和EHEC O157：H717#较弱。以rfbE和fliC为目的基因成功建立了二重PCR,敏感性和特异性良好,可用于临床样品的检测,提高细菌分离率。