Desarrollo de nuevas estrategias para diagnóstico y clasificación de inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos

Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son el tipo de inmunodeficiencias primarias mas comun. Se caracterizan por presentar defectos en la produccion de anticuerpos y un cuadro clinico muy heterogeneo, que incluye desde individuos asintomaticos hasta pacientes con infecciones recurrentes y otras complicaciones no infecciosas, como autoinmunidad y linfoproliferacion, que pueden manifestarse a cualquier edad. La inmunodeficiencia variable comun (IDVC) es la inmunodeficiencia predominantemente de anticuerpos mas importante desde el punto de vista clinico, y los deficits de isotipos de inmunoglobulinas los mas prevalentes. Ambos grupos de enfermedades se caracterizan, ademas de por su alta heterogeneidad clinica, por un origen genetico desconocido en la gran mayoria de los casos, por lo que su diagnostico debe realizarse basandose en una combinacion de criterios clinicos y biologicos. Los niveles de anticuerpos sericos son el parametro mas utilizado tanto para su diagnostico como para su subclasificacion, aunque estos no reflejan de forma adecuada el estado de la respuesta B en un momento dado, ni permiten predecir el comportamiento clinico de estos pacientes a medio/largo plazo. Por ello, en los ultimos anos diferentes estudios han evaluado las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos B de sangre en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos, correlacionandolas ademas con sus manifestaciones clinicas. No obstante, estos trabajos solamente han evaluado un numero limitado de poblaciones, no teniendo en cuenta las subpoblaciones definidas por los isotipos y subclases de inmunoglobulina expresada, ni utilizando valores de referencia por grupo de edad. Ante estos antecedentes, nos planteamos como objetivo principal del trabajo de tesis doctoral desarrollar una metodologia que nos permitiera estudiar en profundidad las subpoblaciones de linfocitos B en sangre mediante citometria de flujo, incluyendo las definidas por el isotipo y subclase de inmunoglobulina, para establecer valores de referencia en donantes sanos por grupo de edad, y de este modo definir con mayor precision las alteraciones observadas en pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos. Para llevar a cabo este objetivo, en primer lugar evaluamos una serie de 28 clones de anticuerpos monoclonales comercialmente disponibles y previamente validados para detectar anticuerpos sericos, dirigidos frente a las subclases de IgG e IgA. De estos, 17 fueron capaces de identificar las subclases de IgG e IgA en la superficie de los linfocitos B de memoria y celulas plasmaticas, de los cuales seleccionamos 6, uno frente a cada una de las subclases de IgG e IgA, de acuerdo a su intensidad de marcaje y su disponibilidad conjugados con fluorocromos compatibles. Posteriormente, estos clones fueron validados, demostrando ser capaces de identificar de forma sensible y especifica su correspondiente subclase de inmunoglobulina en linfocitos B y celulas plasmaticas, tanto en sangre como en otros tejidos humanos, asi como en la superficie y el citoplasma celular. Una vez que disponiamos de la metodologia que nos permitia diseccionar las subpoblaciones de linfocitos B y celulas plasmaticas de acuerdo no solo a su estadio madurativo, sino tambien al isotipo y subclase de inmunoglobulina expresada, nuestro objetivo se centro en conocer en profundidad la distribucion de estas poblaciones B a lo largo de la vida y compararla con los niveles solubles de anticuerpos en plasma. Para ello, analizamos un total de 19 muestras de sangre de cordon umbilical, y 215 muestras de sangre periferica de individuos de distintas edades, desde recien nacidos a mayores de 80 anos. Nuestros resultados mostraron que las subpoblaciones de linfocitos B varian a lo largo de la vida, tanto las definidas por su estadio madurativo como por la expresion de inmunoglobulinas. Asi, las celulas plasmaticas son el compartimento que alcanza sus niveles mas altos a edades mas tempranas, seguidas de los linfocitos B de memoria y los anticuerpos solubles de plasma. Ademas, aquellas subclases de inmunoglobulinas codificadas mas distalmente en el gen IGHC alcanzan sus niveles mas altos, tanto en los compartimentos celulares como solubles, a edades mas avanzadas, probablemente reflejando la existencia de cambios de isotipo/subclase de inmunoglobulina consecutivos a lo largo de la vida. Tras la evaluacion de las subpoblaciones de linfocitos B de acuerdo a la edad, nuestro siguiente objetivo fue la identificacion precisa de las alteraciones de estas poblaciones en pacientes con IDVC y deficits de isotipos de inmunoglobulina, comparando los valores obtenidos con los de donantes sanos del mismo rango de edad. De este modo, pudimos identificar que todos los pacientes analizados presentan alteraciones en al menos una poblacion de linfocitos B y celulas plasmaticas, observandose distintos patrones de alteracion en funcion del diagnostico del paciente. Los casos con deficit selectivo de IgA se caracterizan por presentar defectos en las poblaciones IgA, sin apenas alteraciones en las IgG. Ademas, identificamos dos grupos de pacientes con deficit selectivo de IgA en funcion del grado del defecto en los linfocitos B de memoria IgA, los cuales presentan distinto comportamiento clinico. Asi mismo, los pacientes con IDVC, se caracterizan todos ellos por presentar alteraciones en las celulas plasmaticas, y un deterioro progresivo en la capacidad de cambio secuencial de isotipo/subclase de inmunoglobulina en los linfocitos B de memoria, afectando primeramente a aquellos isotipos y subclases localizadas mas distalmente en el gen IGHC. De este modo, segun el patron de alteracion observado en los linfocitos B de memoria podemos identificar hasta 6 subgrupos de pacientes con IDVC, que a su vez presentan diferentes caracteristicas clinicas. En definitiva, el analisis detallado del compartimento de celulas B, de acuerdo al isotipo y subclase de inmunoglobulina, y a la expresion de otros marcadores funcionales, como CD21 y CD27, constituye una herramienta valiosa y complementaria a los anticuerpos sericos para el diagnostico, la clasificacion y la monitorizacion de los pacientes con inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos.