Pancreatic islet microencapsulation: development of a comprehensive platform for evaluation and optimization of conformal coating with hydrogels for clinical applications

Il trapianto di isole pancreatiche si pone come scopo di ripristinare la presenza di beta-cellule, che vengono distrutte dal sistema immunitario dei pazienti con diabete di tipo 1. Per prevenire il rigetto del trapianto, i pazienti devono sottoporsi a terapia sistemica immunosoppressiva cronica, la quale non e’ completamente efficace e puo’ causare effetti collaterali. Per questo motivo, ad oggi, il trapianto di isole pancreatiche viene effettuato solo nei pazienti piu’ gravi. L’immunoisolamento tramite incapsulamento potrebbe eliminare la necessita’ di trattamento immunosoppressivo, ma il successo clinico della procedura non e’ finora stato raggiunto. Lo scopo di questa tesi di dottorato e’ presentare un nuovo dispositivo per l’incapsulamento conformale di isole con polimeri a base di PEG tramite un sistema fluidodinamico. Il lavoro presentato si propone di superare alcuni dei limiti dell’incapsulamento tradizionale, ed in particolare: i) di ridurre il volume da trapiantare diminuendo lo spessore delle capsule, ii) di incrementare la stabilita’ meccanica delle capsule utilizzando polimeri a base di PEG, iii) di ottimizzare il sito di trapianto di modo da favorire l’attecchimento, iv) di ottimizzare la composizione delle capsule conformali supplementando il PEG con componenti di matrice extracellulare, v) di sviluppare metodi che permettano il controllo e la caratterizzazione veloce di potenziali formulazioni per le capsule grazie e modelli computazionali e tecnologia lab-on-chip, vi) di dimostrare l’applicabilita’ dell’incapsulamento conformale ad approcci di terapia cellulare in ambiti diversi da quello del diabete. Capsule conformali sono state ottenute usando un approccio fluido dinamico: il getto di acqua che si forma tra due fluidi immiscibili (olio e acqua) che fluiscono in maniera coassiale viene rotto tramite l’uso di una geometria a focalizzazione del flusso. Le gocce ottenute sono composte da isole ricoperte da un sottile strato di polimero. Il processo fluidodinamico e’ stato studiato prima in silico tramite un modello computazionale e poi in vitro paragonando diversi prototipi di dispositivo. Le isole sono state incapsulate usando un PEG-divinil-sulfone con l’aggiunta di alginato e reticolato tramite ditiotreitolo (PEG ALG). L’incapsulamento non ha compromesso la vitalita’ e la funzionalita’ delle isole ne’ in vitro ne’ in vivo in un modello di trapianto murino singeneico nella capsula renale (KD). E’ stato poi eseguito uno studio sulla composizione delle capsule e sul sito di trapianto in topi su isole microincapsulate. La sacca epididimale (EFP) si e’ dimostrata un sito di trapianto superiore in termini di riuscita e mantenimento di inversione del diabete a lungo termine. L’aggiunta di PEG all’alginato e la formazione di capsule ibride ha migliorato il tempo di inversione del diabete nella cavita’ intraperitoneale, probabilmente grazie all’innalzamento delle proprieta’ meccaniche delle capsule. Un esito opposto e’ stato ottenuto nel caso dell’EFP, dove problemi di inferiore biocompatibilita’ potrebbero aver causato un tempo di inversione piu’ lungo e un peggiore controllo della glicemia. Le capsule di PEG ALG non sono state in grado di mantenere la normoglicemia a lungo termine in un contesto di allotrapianto in topi. Questo puo’ essere imputato alla struttura macroporosa delle capsule. Per migliorare l’esito dei trapianti, nelle capsule il gruppo divinil-sulfone e’ stato sostituito con il gruppo maleimide, meno reattivo, e come sito di trapianto la capsula renale con la sacca epididimale. L’alginato e’ stato sostituito con il matrigel per fornire alle isole componenti di matrice extracellulare (PEG MG). Le capsule conformali con PEG MG hanno conferito immunoisolamento e hanno reso possibile il mantenimento della normoglicemia a lungo termine in un modello di allotrapianto con completo disaccoppiamento di MHC in assenza di regime immunosoppressivo in topi. I primi passi verso la traslazione clinica sono stati intrapresi rifinendo ulteriormente la composizione delle capsule e del sito di trapianto e sviluppando un modello computazionale del sito di trapianto stesso. I gel di fibrina usati per ancorare le isole alla EFP sono stati sostituiti da uno scaffold biologico (plasma autologo del ricevente il trapianto e trombina ricombinante). Gli scaffold biologici hanno garantito risultati simili ai gel di fibrina in un modello di trapianto singeneico. Inoltre il matrigel, non idoneo per uso clinico, e’ stato sostituito con un peptide polimerico sintetico, pepgel. Dubbi sulla potenziale tossicita’ del ditiotreitolo hanno portato alla sua sostituzione con un PEG-ditiolo lineare di peso molecolare 2KDa. I materiali sono stati inizialmente caratterizzati dal punto di vista biologico (completezza delle capsule, vitalita’ e funzionalita’ delle isole in vitro e in vivo in un modello di trapianto singeneico in topi) e poi adottati come materiale di riferimento per un modello computazionale dell’isola incapsulata conformalmente nel sito di trapianto EFP. Il modello permette di studiare i fenomeni di trasporto del glucosio dal vaso sanguigno al centro dell’isola e dell’insulina nella direzione opposta. Il ritardo totale tra l’incremento nella concentrazione di glucosio nel vaso sanguigno e il rilascio di insulina nella circolazione e’ stato predetto tramite simulazioni in silico. La natura parametrica del modello ha permesso inoltre di mettere a confronto diverse composizioni per le capsule. Infine, e’ stata presentata un’applicazione dell’incapsulamento conformale in un contesto differente da quello del diabete. Cellule renali epiteliali umane sono state usate come esempio per dimostrare l’efficacia dell’incapsulamento conformale in applicazioni potenzialmente infinite della piattaforma di incapsulamento in medicina rigenerativa. In generale, il lavoro presentato dimostra di possedere un grosso potenziale per la traslazione della tecnologia di incapsulamento conformale in applicazioni cliniche.