Especific roles of endolysosomal trafficking in melanoma progression and drug response

Summary Melanoma was first described as a tumor entity in 1806, and it has since remained a prime example of a heterogeneous, aggressive and treatment-resistant malignancy. Despite great progress made in the understanding of the molecular basis underlying melanoma initiation and progression, the field still lacks clinically relevant biomarkers, consensus on metastatic progression mechanisms and effective treatments for the management of advanced stages. Consequently, this PhD thesis was set to: (1) identify new genes driving melanoma pathogenesis, (2) characterize their role in tumor initiation and progression, and (3) use this information for the development of novel therapeutic strategies. We focused on the study of lineage-specific traits as a strategy to identify novel factors that might be inherently and distinctively altered in melanoma. Mining of multi-tumor gene expression data sets identified a cluster of lysosomal genes that is uniquely enriched in melanoma cells and that distinguishes this tumor type from over 35 malignancies. Within this cluster, we demonstrated a dependency of melanoma cells on the GTPase RAB7, which was observed to maintain cell proliferation in a tumor type-selective manner. In contrast to classical melanoma-associated oncogenes such as BRAF, whose depletion blocks both cell proliferation and invasion, tuning down RAB7 favored the transition to metastatic stages. RAB7 levels were found to affect melanoma cell phenotype by modulating the fate of PI3K-driven vesicles, which instead of being directed towards the lysosome for degradation, accumulated and were diverted into secretory pathways when RAB7 expression was tuned-down. The outcome of derailed RAB7-regulated vesicle traffic translated into melanoma-cell selective changes in gene expression profiles, cytoskeletal reorganization, and secretion modulators of extracellular proteolysis and matrix remodeling. Importantly, we found RAB7 to be expressed independently of MITF, the best known lineage-specific melanoma oncogene characterized to date. Instead, we identified that, in melanoma cells, RAB7 levels are controlled by both SOX10, an early driver of the melanocytic lineage, and PI3K signaling, which is frequently activated during tumor initiation. These results were revealed by computational methods, live microscopy, histological and functional analyses of human biopsies, cell lines and mouse models. Moreover, the clinical relevance of these results was demonstrated in follow-up studies of patient prognosis. Finally, here we demonstrated that tumor-cell specific features of RAB7-dependent vesicle traffic have the potential to be exploited therapeutically. Specifically, we found a novel strategy (based on dsRNA-based nanocomplexes) to promote an efficient self-killing of melanoma cells by inducing a massive mobilization of autophagosomes, endosomes, and lysosomes, and the subsequent activation of apoptotic caspases. Together, the results of this PhD thesis underscore a unique lineage-restricted wiring of endolysosomal pathways that actively contributes to melanoma progression and serves as a tractable vulnerability that can be pursued for drug development. Key words: Lineage dependency; macropinocytosis; late endosomes; small GTPases; tumor development; cell invasion; melanoma. Resumen El melanoma se describio por primera vez como una entidad tumoral en 1806, y desde entonces, se mantiene como ejemplo de neoplasia agresiva, heterogenea y quimiorresistente. A pesar de avances notables en la compresion de las bases moleculares de la progresion del melanoma, no se dispone de biomarcadores con suficiente valor pronostico. Del mismo modo, no existe un consenso sobre los mecanismos que subyacen al proceso de metastasis, ni se han desarrollado tratamientos eficaces para las fases avanzadas de la enfermedad. Por todo ello, esta tesis doctoral se ha centrado en: (1) identificar nuevos genes esenciales para el desarrollo del melanoma, (2) definir su regulacion y su funcion en la progresion tumoral, y (3) utilizar esta informacion para el desarrollo de nuevas estrategias terapeuticas. En particular, nos centramos en el estudio de caracteristicas especificas de linaje celular con el fin de identificar nuevos factores pro-oncogenicos inherentes al melanoma. El analisis de perfiles de expresion genica de diversos tipos tumorales revelo que las muestras de melanoma presentan un enriquecimiento selectivo de genes codificantes de proteinas lisosomales, que distingue a este tipo de cancer de mas de otros 35 tipos tumorales distintos. Dentro de esta huella genetica, identificamos la GTPasa RAB7 como un nuevo gen esencial para el mantenimiento de la capacidad proliferativa de estas celulas tumorales. A diferencia de ?oncogenes? clasicos como BRAF, cuya inactivacion inhibe tanto la proliferacion como la invasion tumoral, la reduccion en los niveles de RAB7 favorece la transicion a estadios metastasicos. Encontramos que esta doble funcion oncogenica de RAB7 se debe a su capacidad para regular el destino final (degradacion o reciclaje) de vesiculas citoplasmaticas inducidas por rutas oncogenicas que activan PI3K. La desregulacion de trafico vesicular controlado por RAB7 produce cambios globales en los perfiles de expresion genica de las celulas de melanoma, afectando a genes implicados en rutas de senalizacion clave en cancer. Ademas, afecta al citoesqueleto y la secrecion de factores involucrados en la remodelacion de la matriz extracelular. Por otro lado, determinamos que RAB7 se expresa y actua de manera independiente de MITF, el oncogen especifico de melanoma mejor conocido hasta el momento. En cambio, demostramos que la expresion selectiva de RAB7 en las celulas de melanoma esta controlada especificamente por SOX10, el factor mas apical en la diferenciacion melanocitica, y por la via de senalizacion de PI3K, activada frecuentemente durante la iniciacion tumoral. El papel de RAB7 en la progresion del melanoma se determino mediante estudios en lineas celulares humanas, biopsias clinicas y modelos animales. Ademas, la relevancia clinica de estos datos se determino en estudios de seguimiento a 10 anos, en los que se demostro que los niveles de expresion de RAB7 determinan el riesgo de desarrollo de metastasis en pacientes. Finalmente, demostramos que las rutas de trafico vesicular dependientes de RAB7 que estan especificamente activadas en celulas tumorales pueden constituir nuevas dianas terapeuticas. En concreto, desarrollamos una estrategia (basada en nanoparticulas de ARN de doble cadena) para inducir la autodestruccion de las celulas tumorales a traves de la movilizacion de macroendosomas, autofagosomas y lisosomas, y la posterior activacion de caspasas apoptoticas. En conjunto, los resultados de esta tesis doctoral han revelado una regulacion y activacion de la maquinaria endolisosomal que se establece de forma especifica en el melanoma, contribuyendo a la progresion de esta enfermedad, y que, por otro lado, tambien confiere una vulnerabilidad a las celulas tumorales que puede ser explotada con fines terapeuticos. Palabras claves: adiccion oncogenica; linaje celular; macropinocitosis; endosomas; pequenas GTPasas; progression tumoral; invasion tumoral; melanoma.