兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b^0,+AT多克隆抗体的制备及其效价和特异性分析

为了获得兔抗鸡碱性氨基酸转运载体bo’＋AT多克隆抗体，并对多克隆抗体进行特异性分析，本试验利用鸡bo’＋ATcDNA全序列（GenBank登录号HQ338713）进行生物信息学分析，预测其蛋白质理化性质、跨膜区域、二级结构及抗原表位，并设计出1段抗原多肽；构建鸡pET-32a（＋）-bo’＋AT质粒，原核表达融合蛋白经纯化后，注射于新西兰大白兔，经3次加强免疫后，制备兔抗鸡bo’＋AT多克隆抗体，并采用酶联免疫分析（ELISA）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术分析其效价和特异性。结果如下：1）鸡肠道bo’＋AT分子质量为53．8ku，等电点为8．27，编码493个氨基酸，其中含33个强碱性氨基酸残基（K、R）、28个强酸性氨基酸残基（D、E）、235个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V）、122个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y）；经推测，bo’＋AT有12个跨膜螺旋结构，由32．05％α-螺旋、25．96％延伸链和41．99％无规则卷曲组成。2）成功构建了鸡pET-32α（＋）-bo’＋AT丁质粒并获得兔抗鸡bo’＋AT多克隆抗体，抗体效价可达到l：204800，且特异性较好。3）利用制备的兔抗鸡bo’＋AT多克隆抗体作为一抗，肠道组织膜蛋白为抗原，采用Westernblot验证获得预期的特异性条带，一抗稀释比例为1：4000。结果提示，本试验成功制备了与膜蛋白bo’＋AT特异性较好的多克隆抗体，同时其在鸡肠道组织中具有较好的应用效果。