Hormônio de crescimento recombinante de tambaqui (Colossoma macropomum): otimização da expressão em frascos agitados e produção em biorreator

A expressao heterologa do hormonio de crescimento recombinante de tambaqui (rtGH), Colossoma macropomum, na levedura metilotrofica Pichia pastoris aponta a perspectiva de geracao de um produto biotecnologico inovador para a piscicultura brasileira, em especial para o cultivo do tambaqui. Nessa perspectiva, esta pesquisa teve por objetivo avaliar o potencial de expressao do rtGH na levedura P. pastoris, em sistema de frascos agitados e em biorreator. Inicialmente foi realizada uma selecao dos clones transformantes de P. pastoris com capacidade de produzir os melhores niveis de rtGH, levendo em consideracao o fenotipo. Para melhorar o nivel de expressao do rtGH em sistema de frascos agitados, foram utilizadas as ferramentas estatisticas de planejamento experimental fatorial. Primeiramente, um screening design baseado no delineamento Plackett e Burman foi utilizado para selecao dos parâmetros mais significativos relacionados a producao de rtGH e biomassa: extrato de levedura, peptona, ureia, tampao fosfato, biotina, metanol, inoculo e pH. Posteriormente, os parâmetros selecionados, metanol e peptona, foram avaliados em DCCR e analisados por meio da metodologia de superficie de resposta. Por fim, foi realizada uma fermentacao conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol e o perfil cinetico de producao do rtGH determinado. Os resultados obtidos indicaram o clone 32b, fenotipo Mut+, como o mais produtivo. O metanol foi apontado como o parâmetro mais importante para a producao do rtGH, seguido da peptona, biotina e inoculo. Em relacao a formacao de biomassa, o metanol, extrato de levedura e tampao fosfato foram os parâmetros mais importantes. De acordo com o modelo obtido, as concentracoes de 1,55 % de metanol e 2,8% de peptona foram consideradas otimas para producao do rtGH. O modelo foi validado com aumento da producao de rtGH de 0,3 mg/L para 2,4 mg/L na condicao otimizada. A fermentacao em biorreator, conduzida em batelada alimentada por pulsos de metanol, resultou num nivel de producao de rtGH de 250 mg/L, aproximadamente 100 vezes superior ao obtido em frascos agitados. Esta pesquisa foi pioneira no desenvolvimento de estrategias de otimizacao da producao do rtGH em P. pastoris utilizando frascos agitados e biorreator.