Virulence factors in Streptococcus pyogenes

Wahrend meiner Dissertation lag mein Interesse in der Erweiterung des Verstandnisses der Pathogenitat des bekannten humanen Pathogens Streptococcus pyogenes, auch bekannt als Gruppe A Streptococcus (GAS). Dieses Manuskript ist in vier Teile unterteilt: 1) die Rolle von Superantigen-codierenden lysogenen Bakteriophagen in Erwerb und Verbreitung von Virulenzgenen in Streptococci, 2) der Identifikation von small RNAs mit potentiellen regulatorischen Funktionen in GAS, 3) der Rolle des interspezifischen Kommunikationssystems luxS/AI-2 in GAS Metabolismus und Uberleben unter Stresskonditionen und 4) der Rolle von Streptolysinen in der angeborenen Immunantwort von Makrophagen auf GAS Infektion. 1) Seit den spaten 1980er Jahren, war ein signifikanter Anstieg von schweren Formen durch GAS verursachter Krankheiten im Menschen zu beobachten. Eine Hypothese um dieses Phanomen zu erklaren, beruht auf einer gesteigerten Virulenz des Pathogens selbst. In GAS codieren Prophagen fur einen oder mehr putative oder bekannte Virulenzfaktoren, einschlieslich Superantigenen. Im ersten Teil meiner Dissertation wird die Identifikation des induzierbaren Prophagen F149, welcher fur das Superantigen SSA in einem klinischen Isolat von GAS des Serotyps M12 codiert, beschrieben. Durch lysogene Konversion war der Phage zwischen klinischen Isolaten von verschiedenen GAS M-Serotypen (M1, M3, M5, M12, M19, M28 und M94), als auch in Gruppe C Streptococcus equisimilis (GCSE), ex-vivo transferierbar. Unsere Ergebnisse zeigen, dass horizontaler Transfer von lysogenen Phagen zwischen GAS durch die M-Typ-Barriere moglich ist und unterstutzen das Konzept der interspezifischen lysogenen Toxin-Konversion. Somit wurde lysogene Konversion es GAS ermoglichen, sich effizienter an die wechselnden Bedingungen im Wirt anzupassen, was wiederum zu potentiell konkurrenzfahigeren, virulenteren Klonen fuhren wurde. 2) Kurzlich erschienene Studien zeigen, dass small RNAs (sRNAs) in Bakterien eine signifikante Rolle in der Regulation der Genexpression spielen. Jedoch sind Informationen uber die Rolle von sRNAs in S. pyogenes relativ begrenzt. Aus diesem Grund war unser Ziel im zweiten Abschnitt meiner Arbeit die Identifikation neuer sRNAs in S. pyogenes. Zu diesem Zweck wurde ein in silico Verfahren angewandt, fokussierend auf die intergenen Regionen des Genoms von M1-Serotyp GAS. Von 178 identifizierten putativen Loci wurden 90 zur weiteren Analyse ausgewahlt, wobei 29 (32%) dieser sRNAs unter normalen Wachstumsbedingungen exprimiert werden. Die Expression der Kandidaten wurde verifiziert in den Serotypen M1, M3, M5 und M49, ihre 5’ und 3’ Enden wurden determiniert, ihre Stabilitat bestimmt und ihre in silico Sekundarstruktur wurde vorhergesagt. Gefunden wurden 5 Riboswitches, 6 leader elements, 4 funktionelle RNAs, 8 T-Boxen und 5 neue sRNAs. Zwei dieser sRNA Kandidaten befinden sich in der 5’ UTR von Riboflavin- und Tryptophan- Transportergenen und scheinen diese Gene durch trankriptionelle oder translationelle Attenuierungsmechansimen zu kontrollieren. Das zeigt die Wichtigkeit von sRNAs in der Kontrolle der Aufnahme essentieller Metaboliten in Bakterien durch regulatorische Genexpression. Zusatzlich wurde eine in der intergenen Region identifizierte sRNA SpyRNA049 auf ihre potentielle Rolle in GAS-Pathogenitat weiter analysiert. 3) Fruhere Studien zeigten, dass das interspezifische Zell-Zell-Kommunikationssystem luxS/AI-2 eine Rolle in Metabolismus und Pathogenitat spielt. Im dritten Abschnitt meiner Dissertation war das Ziel, die Rolle des luxS/AI-2 Systems in den S. pyogenes Serotypen M1 und M19 zu verstehen. Unsere Ergebnisse lassen auf eine limitierte Rolle von luxS/AI-2 im S-Adenosylmethioninzyklus schliesen. Uberlebensassays mit luxS-Mutanten sowie luxS-Expression und AI-2-ahnliche Aktivitatsassays im leicht sauren Milieu demonstrierten die Beteiligung des luxS/AI-2 Systems in der Stressadaptation von GAS. Interaktionsanalyse mit Wirtszellen zeigte, dass die luxS-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp in hoherem Ausmas in Epithelzellen und Makrophagen uberlebten. Alles in allem zeigen unsere Daten, dass das luxS/AI-2 System nicht nur in die Regulation der Virulenzfaktorexpression involviert ist, sondern auch fur Bakterien einen Vorteil darstellt, in herausfordernden Wirtsumgebungen zu uberleben. 4) Im Allgemeinen werden Bakterien von den Immunzellen des Wirts durch pattern recognition receptors, wie Toll-like receptors (TLRs), erkannt. Uber die Erkennung von GAS durch Makrophagen ist jedoch wenig bekannt. Die Ergebnisse, die im vierten Teil meiner Dissertation beschrieben werden, lassen darauf schliesen, dass Makrophagen S. pyogenes unabhangig von den TLRs die typisch fur gram-positive Pathogene sind (TLR2, TLR4 und TLR9 sowie ihre Kombinationen), erkennen. Jedoch waren die in Makrophagen beobachteten Signalereignisse auf GAS-Infektion immer noch abhangig vom TLR-Adaptor MyD88. Uberraschenderweise war die IFN-Produktion unabhangig von den GAS-Cytolysinen SLS und SLO, die oft von anderen gram-positiven Bakterien benotigt werden. Alles in allem lassen unsere Ergebnisse darauf schliesen, dass GAS durch einen MyD88-abhangigen Rezeptor, anders als die ublicherweise verwendeten, erkannt wird und lassen einen neuen Typ der bakteriellen Erkennung fur die Produktion von TypI IFN erkennen.