Selective and accurate translation by protein-depleted ribosomes formed in E. coli in the presence of kasugamycin in vivo

Kasugamycin ist ein Antibiotikum aus der Klasse der Aminoglycoside. Es inhibiert die Ausbildung des Translationsinitiationskomplexes an kanonischen mRNAs, indem es die Bindung der mRNA in der ribosomalen P-Stelle blockiert. Im Gegensatz dazu inhibiert es aber nicht die Initiation der Translation von sogenannten „leaderless mRNAs“, die direkt mit einem 5´-terminalem Startcodon beginnen und somit keine zusatzlichen Startsignale fur das Ribosom aufweisen. Vor kurzem wurde gezeigt, dass in E. coli in Anwesenheit von Kasugamycin Ribosomen gebildet werden, denen einige Proteine der 30S Untereinheit fehlen. Zu den fehlenden Proteinen gehoren unter anderem die essentiellen Proteine S1 und S2, und das Protein S12. Da bekannt ist, dass Kasugamycin –im Gegensatz zu anderen Aminoglycosiden- keinen Einfluss auf die Fehlerrate hat und nicht zu einer Verschiebung des Leserahmens wahrend der Translation fuhrt, konnte das Fehlen von S12, das die Translationsgenauigkeit des Ribosoms negativ beeinflusst, ein Hinweis darauf sein, dass die protein-defizienten Partiklen eine hohere Genauigkeit in der Translation aufweisen. Daher war das erste Ziel meiner Arbeit, diese Hypothese zu bestatigen. Mit Hilfe von „leaderless“ GFP-Konstrukten wurde die Translationsgenauigkeit in vivo nach Zugabe von Kasugamycin bestimmt. Die Resultate deuten darauf hin, dass die Fehlerrate der ribosomalen Partikel im Vergleich zu vollstandig assemblierten Ribosomen geringer ist. Vorangegangene Experimente haben gezeigt, dass die Behandlung von E. coli mit Kasugamycin die Translation vollstandig hemmt. Interessanterweise haben wir im Laufe der oben genannten Studien beobachtet, dass nach langerer Inkubation mit dem Antibiotikum die Synthese von einigen Proteinen wieder beginnt. Da in E. coli keine leaderless mRNAs bekannt sind und die Synthese der Proteine resistent gegen Kasugamycin ist, war das zweite Ziel meiner Arbeit, dieses Phanomen naher zu untersuchen. Nach der Identifizierung der Proteine mittels 2D-Gel-Analyse und Massenspektrometrie wurden die 5´-Enden der korrespondierenden mRNAs bestimmt. Die Studien haben gezeigt, dass diese mRNAs in Gegenwart von Kasugamycin durch einen alternativen Transkriptionsstart nahe am AUG Startcodon oder durch RNA-Degradierung „leaderless“ geworden sind. Weiters deuten die Ergebnisse darauf hin, dass eine RNA Interferase, MazF, an diesem Prozess beteiligt ist. Zusammengefast, weisen die Resultate meiner Arbeit auf eine noch nicht beschriebene Uberlebensstrategie von Bakterien hin, die induziert wird, wenn die Translation gehemmt wird. Unter diesen Bedingungen konnte es zur Bildung von „leaderless“ mRNAs kommen, die selektiv von protein-defizienten Ribosomen translatiert werden konnen. Die Synthese dieser spezifischen Proteine konnte zum Uberleben der Bakterien unter ungunstigen Bedingungen beitragen.