嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus RecJ核酸酶的表达纯化及酶学特征

目的克隆表达嗜热古菌Archaeoglobus fulgidus（A.fulgidus）来源的RecJ核酸酶基因（ORF编号AF_0699，NCBI数据库基因登陆号为AF_RS03550），对该重组蛋白的核酸酶活性及酶学特征进行鉴定和分析。 方法将A.fulgidus RecJ（AfuRecJ）核酸酶在大肠杆菌中进行重组表达，经亲和层析纯化得到电泳纯蛋白；利用人工合成的带有末端荧光标记的寡核苷酸作为底物，体外反应后，利用8 mol/L尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定AfuRecJ核酸酶的水解产物。 结果AfuRecJ核酸酶具有单链DNA特异性的3'-5'外切核酸酶活性，酶活性依赖于二价金属离子Mn2+或Mg2+，且Mn2+存在条件下的催化效率明显优于Mg2+；其最适反应温度范围为55-65℃；高于200 mmol/L的NaCl会显著抑制AfuRecJ的核酸酶活性。AfuRecJ还具有单链RNA 3'-5'外切酶活性，且活性高于单链DNA底物。单链核酸3'末端的磷酸基团对水解活性有一定抑制作用。AfuRecJ对单链核酸的长度有一定的选择性，可以有效水解长度≥4个核苷酸长度的单链RNA、≥12个核苷酸长度的单链DNA，而且对双链DNA中的3'单链DNA结构（3'突出单链尾巴与末端分叉结构）具有类似单链DNA的水解活性。 结论本研究证实AfuRecJ是一种单链核酸特异性的3'-5'外切核酸酶，且相比单链DNA，单链RNA为优势底物，推测其在胞内可能参与RNA降解与DNA修复。