Synthèse de nucléotides triphosphates modifiés pour le diagnostic moléculaire par reséquencage sur puces à ADN

Notre projet etait de mettre au point une methode de marquage rapide et selective d'acides nucleiques, l'objectif etant de pouvoir utiliser ceux-ci pour le resequencage sur puces a adn. Notre approche a consiste en la synthese de ribonucleotides triphosphates porteurs d'une fonction reactive. Ces triphosphates modifies ont ete incorpores par voie enzymatique dans des sequences d'arn afin de generer des acides nucleiques fonctionnalises. Les arn ainsi actives ont ensuite ete marques en utilisant un fluorochrome. Nous avons synthetise des nucleotides triphosphates en serie uridine, adenosine et cytidine porteurs de fonctions reactives de type oxyamine (onh 2) ou methylcetone (coch 3). Les fluorophores correspondants, modifies avec une fonction aldehyde ou oxyamine, ont ete prepares. Nous avons ensuite mis au point les conditions de post-marquage des acides nucleiques fonctionnalises. Les arn marques ont ete utilises pour le resequencage sur puces a adn. Les acides nucleiques detectes ont ete soit un fragment de l'arn 16s de mycobacterium tuberculosis soit un fragment du gene codant pour la transcriptase inverse de hiv-1. Apres hybridation sur puces, nous avons obtenu des pourcentages d'homologie voisins de 100%, montrant la selectivite et l'efficacite de notre methode de marquage.